The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

29 
Chapter I 
Table  2.1:  Data  collection  and  refinement  statistics  of  DR2/MBP.  The  data  set  was  collected  at 
beamline  X25  at  the  National  Synchrotron  Light  Source  (Brookhaven  Laboratories,  Upton,  NY,  USA). 
The  crystal  was  grown  in  100  mM  glycine  (pH  5.2),  15  %  PEG  6,000  and  20  mM  sodium  acetate  at 
18 ºC. Values in parenthesis refer to the highest resolution shell.
 
 
Data collection 
 
Space group 
P3
1
 
Cell dimensions 
 
a, b, c (Å) 
119.2, 119.2, 76.2 
Resolution (Å) 
50.0-2.90 (2.95-2.90) 
R
merge
 (%) 
8.4 (44.1) 
I/σI 
35.0 (2.5) 
Completeness (%) 
98.9 (90.5) 
Redundancy 
4.9 (2.9) 
Refinement 
 
Resolution (Å) 
42-2.90 
No. unique reflections 
26527 (1229) 
R
work
/R
free
 (%) 
22.4/27.5 
Number of atoms (ASU) 
 
Protein 
6116 
Peptide 
264 
Water 
183 
B-factors (Å
2
) 
 
Protein 
83.5 
Peptide 
88.2 
Water 
85.3 
R.m.s. deviations 
 
Bond lengths (Å) 
0.008 
Bonds angles (º) 
1.399 
 
2.3.2
 
Preparing and characterizing 
15
N-labeled MBP peptide  
As the small molecule might have bound to only a subset of DR molecules in the co-
crystal  structure  and might  have a  fast  on/off rate,  NMR  spectroscopy  was  pursued  to 
investigate  small  molecule  binding  in  solution.  To  track  MBP  peptide  bound  to  DR2 
upon  small  molecule  binding  the  peptide  was  labeled  with  different  isotopes.  For 
isotope  labeling,  the  15  amino  acid  long  MBP  peptide  (ENSVVHFFKNIVTSR)  was 
expressed  separately  from  the  DR  protein  (as  a  trpLE  fusion  protein).  The  peptide 
sequence  corresponds  to  the  MBP  protein  sequence  85-99  except  that  two  prolines  at 
positions  three  and  14  were  substituted  with  serine.  Prolines  were  replaced  as  they 
generate no resonances in 
1
H-
15
N HSQC experiments due to absence of amide protons. 
For the initial NMR experiments the MBP-peptide was 
15
N-labeled and the yield of 
the peptide together with the fusion protein was 140 mg per 1 liter bacterial culture. The 
peptide together with the fusion protein was purified following the preparation scheme 
shown  in  figure  2.2.  Using  SDS-PAGE  it  was  determined  that  ~  70%  of  the  MBP-
fusion  protein  was  cleaved  using  CNBr.  The  correct  mass  of  the  purified  peptide  was 

---

30 
Chapter I 
verified by mass spectrometry (see figure 2.3). 3 mg of purified peptide were obtained 
from 1 liter of bacterial culture and around 7 mg of purified 
15
N-labeled MBP peptide 
were prepared.  
 
expression in E. coli in M9 minimal media (
15
NH
4
Cl) 
 
 
inclusion body preparation  
 
 
 
Ni
2+
-affinity chromatography 
 
 
CNBr cleavage  
 
 
dialysis and neutralization (precipitation)  
 
 
lyophilization of supernatant  
 
 
reverse phase HPLC  
 
Figure 2.2: Preparation scheme of 
15
N-labeled MBP peptide. The MBP peptide sequence together 
with the trpLE fusion protein was expressed in E. coli in M9 minimal media adding 
15
NH
4
Cl for isotope 
labeling.  After  inclusion  body  preparation  the  fusion  protein  was  captured  using  Ni
2+
-affinity 
chromatography. After elution the peptide was cleaved from the fusion protein using CNBr under acidic 
conditions. Upon dialyzing and neutralizing the cleaved fusion protein precipitated and the short peptide 
stayed in solution. The supernatant was lyophilized and the peptide was further purified by reverse phase 
HPLC.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figure  2.3:  Mass  spectrum  of  purified 
15
N-labeled  MBP  peptide.  The  spectrum  shows  a  single 
major peak at ~ 1800 Da corresponding to the mass of 
15
N-labeled MBP peptide. 
 

---

31 
Chapter I 
2.3.3
 
Preparing the complex of HLA-DR2 and 
15
N-labeled MBP peptide  
For the NMR experiments the 
15
N-labeled MBP peptide was loaded onto DR2/CLIP 
molecules.  DR2/CLIP  had  been  previously  expressed  in  CHO  cells  and  purified  by 
affinity chromatography. The CLIP peptide was covalently linked to the N-terminus of 
the  DRß  chain  with  a  thrombin-cleavable  linker  which  was  cleaved  before  peptide 
exchange.  
As  the  isotope  labeled  MBP  peptide  carried  no  affinity  tag  the  DR2/
15
N-MBP 
complex  could  not  be  separated  from  remaining  DR2/CLIP  after  peptide  exchange. 
However, MBP peptide binds with high-affinity while CLIP peptide has low-affinity for 
DR2 molecules. Thus, the CLIP peptide could be quantitatively exchanged with excess 
of 
15
N-labeled  MBP  peptide  present.  To  determine  how  much  CLIP  peptide  was 
exchanged  synthesized  MBP  peptide  carrying  a  DNP-label  was  loaded  onto  cleaved 
DR2/CLIP  molecules  using  the  same  peptide  loading  conditions  as  used  for  isotope-
labeled  MBP  peptide  (2.2.2).  After  removing  free  peptide  by  gel  filtration  it  was 
determined that ~ 80% of DR2 molecules were loaded with MBP peptide measuring the 
absorbance  at  350  nm  which  is  specific  for  DNP.  Furthermore,  as  the  remaining 
DR2/CLIP complex was not isotope labeled it did not give rise to any NMR signal.  
When 
15
N-labeled  MBP  peptide  was  loaded  onto  cleaved  DR2/CLIP  molecules  the 
same peptide loading protocol was followed (2.2.2) and unbound peptide separated by 
gel  filtration.  During  the  size  exclusion  chromatography  the  sample  was  also 
equilibrated to low salt buffer which was used for the NMR experiments. The purified 
DR2/
15
N-MBP complex was concentrated to ~ 21 mg/mL. 
 
2.3.4
 
Measuring 
1
H-
15
N HSQC  spectra  of 
15
N-labeled  MBP  peptide  free  in 
solution and in complex with HLA-DR2 
At  first  a  tr-HSQC  spectrum  of 
15
N-labeled  MBP  peptide  free  in  solution  was 
collected. For the NMR experiments 
15
N-labeled MBP peptide was dissolved in citrate 
buffer at a concentration of 0.33 mM and the spectrum measured at a 
1
H frequency of 
750  MHz.  As  can  be  seen  in  figure  2.4  the  tr-HSQC  spectrum  of 
15
N-labeled  MBP 
peptide shows 13 strong peaks  for the peptide backbone (see bordered peaks in  figure 
2.4) and some weaker peaks in the high field region of the spectrum for nitrogen-bound 
protons of peptide side chains (presumably  asparagines and arginine). The reason why 
13 instead of 15  backbone  peaks  were observed  for the 15  amino acid  long peptide is 

---