The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

22 
Chapter I 
2
 
Chapter  I:  Investigating  enhanced  peptide  exchange  of 
MHC class II molecules by the small molecule catalyst J10 
2.1
 
Introduction 
Peptides  presented  by  MHC  II  molecules  on  the  cell  surface  play  a  pivotal  role  as 
they can evoke different immune responses upon interaction with CD4+ T cells which 
can lead to  antibody production  (Vinuesa et  al.,  2005), cell destruction by  cytotoxic T 
cells (Behrens et al., 2004) or formation of CD4+ regulatory T cells (Sakaguchi, 2010). 
Actively  modifying  the  repertoire  of  presented  peptides  is  therefore  of  interest  for 
various  medicinal  applications  including  peptide  based  vaccination  (e.g.  therapeutic 
cancer vaccination) and treatment with peptide immunomodulators (e.g. Copaxone used 
for  treatment  of  multiple  sclerosis).  However,  the  efficiency  with  which  administered 
peptides  are  loaded  onto  MHC  II  molecules  is  usually  very  low,  with  the  therapeutic 
peptide often proteolytically degraded before it can be loaded onto a MHC II molecule. 
Therefore,  enhancing  MHC II  loading  could  improve  the  efficacy  of  peptide-based 
therapeutics.  
Our  lab  previously  identified  a  small  molecule  (Nicholson  et  al.,  2006)  called  J10 
that  significantly  accelerates  the  rate  of  peptide  loading  onto  DR  molecules  in  the 
absence  of  DM.  Different  from  previously  discovered  MHC II  loading  enhancers 
(MLE) with activities at millimolar concentrations, J10 is active in the low micromolar 
range, which makes it more suitable as a potential adjuvant for peptide vaccination and 
immunotherapies.  Different  from  DM,  J10  catalyzes  peptide  exchange  also  at  neutral 
pH  although  it  has  optimal  activity  at  an  acidic  pH,  like  DM.  Catalyzing  peptide 
exchange  at  neutral  pH  could  be  advantageous  if  J10  is  used  as  adjuvant  for  peptide 
therapeutics as it could load peptides on MHC II molecules present in early endosomes 
and  on  the  cell  surface.  Furthermore,  it  was  shown  that  J10  enhances  peptide 
presentation  by  MHC II  molecules  in  vivo  (Call  et  al.,  2009).  Extensive  medicinal 
chemistry  has  been  already  carried  out  which  improved  the  activity  of  the  small 
molecule.  However,  as  J10  and  its  derivatives  have  high  potential  as  adjuvant  for 
peptide therapeutics and might reveal a highly peptide receptive DR conformation also 
relevant for the peptide exchange mechanism of DM, it is of great interest to understand 
how the small molecules catalyze peptide exchange.  

---

23 
Chapter I 
Two  methods  were  applied  to  investigate  the  peptide  exchange  mechanism  of  J10; 
first,  X-ray  crystallography  to  explore  the  binding  site  of  the  small  molecule,  and 
second,  NMR  spectroscopy  to  investigate  peptide  release  catalyzed  by  the  small 
molecule in solution. At first, attempts to crystallize J10 derivatives (J10-1, J10-12, see 
figure 2.1) together with the MHC II/peptide complex DR2/MBP were carried out using 
co-crystallization  and  ligand  soaking.  Identification  of  the  specific  binding  site  of  J10 
would  help  to  design  small  molecules  with  a  higher  affinity  and  therefore  higher 
potency  for  potential  therapeutic  applications.  To  investigate  the  effect  of  J10  binding 
on DR2/MBP in solution, NMR experiments were performed. HSQC spectra of isotope 
labeled MBP peptide in complex with DR2 were measured before and after addition of 
a J10 derivative. By comparing the HSQC spectra chemical shifts and intensity changes 
could  be  detected  and  together  with  the  peak  assignment  could  provide  information 
about  which  part  of  the  peptide  is  affected  by  small  molecule  binding.  For  isotope 
labeling,  the  peptide  had  to  be  expressed  separately  from  DR2  and  subsequently 
quantitatively  exchanged  against  an  already  bound  lower-affinity  peptide  (in  this  case 
CLIP peptide). The most active J10 derivative was chosen for small molecule addition 
(J10-1, see figure 2.1). Furthermore, to qualitatively measure binding of J10 to low- and 
high-affinity MHC II/peptide complexes 
19
F-NMR experiments of a J10 derivative were 
performed (J10-11, see figure 2.1).  
The  application  of  these  two  complementary  methods  was  utilized  to  gain  a 
comprehensive  molecular  understanding  of  the  MHC II/J10  interactions  and  their 
interplay with peptide-binding. The findings could guide further small molecule design 
as well as provide new information about peptide-binding to and release from MHC II 
molecules in general.  
 
 
 
 
 
 
 
Figure 2.1:  Chemical  structures of the  most active  J10 derivatives enhancing MHC II loading. 
From  right  to  left  the  activity  of  the  small  molecules  increases.  The  small  molecules  J10-1  and  J10-12 
were used for co-crystallization trials. NMR experiments with isotope-labeled MBP peptide were carried 
out using the small molecule J10-1 and 
19
F-NMR spectra were collected of the small molecule J10-11. 
 

---

24 
Chapter I 
2.2
 
Materials and Methods 
2.2.1
 
Preparation and crystallization of HLA-DR2/MBP in the presence of J10-1 
and J10-12 
Soluble  DR2/MBP  was  expressed  in  Sf9  insect  cells  using  the  baculovirus  system 
(pAcDB3  plasmid  with  BaculoGold  Baculovirus;  BD  Biosciences).  The  MBP  (85-99) 
peptide  (ENPVVHFFKNIVTPR)  was  covalently  linked  to  the  N-terminus  of  the  DRß 
chain  with  a  thrombin-cleavable  linker.  The  hydrophobic  transmembrane  regions  of 
DRα  and  DRß  were  replaced  with  leucine  zipper  dimerization  domains  from  the 
transcription factors Fos and Jun (Kalandadze et al., 1996). The protein was purified by 
affinity  chromatography  using  mAb  L243  (American  Type  Culture  Collection).  The 
leucine  zipper  dimerization  domains  were  cleaved  with  V8  protease,  and  for  some 
DR2/MBP complexes the peptide linker was cut with thrombin. The protein was further 
purified by anion exchange chromatography.  
For co-crystallization experiments DR2/MBP was concentrated to ~ 10 mg/mL and 
incubated with 2 mM J10-1 or 2 mM J10-12 at 25 ºC or 37 ºC. Crystals were obtained 
at  18 ºC  in  100  mM  glycine,  pH  5.1-5.4,  14-18%  PEG  6000  and  20  mM  or  50  mM 
sodium  acetate  using  the  hanging  drop  method.  For  soaking  experiments  the  crystals 
were transferred into a solution containing the crystallization conditions and 2 mM J10-
1 or 2 mM J10-12, crystals were incubated at 25 ºC for 4 h. Crystals were flash cooled 
in liquid nitrogen using 30 % glycerol or 35 % ethylene glycol as cryoprotectant.  
Diffraction data were collected on beamline X25 at the National Synchrotron  Light 
Source  (Brookhaven  Laboratories,  Upton,  NY,  USA)  with  a  resolution  of  up  to  3 Å. 
Data  were  processed  with  HKL2000  (Otwinowski  and  Minor,  1997).  DR2/MBP 
crystallized in the hexagonal space group P3
1
 with unit cell dimensions a = b = 118.6 Å, 
c  =  75.4  Å  and  two  molecules  per  asymmetric  unit.  The  structure  was  determined  by 
molecular replacement with the program MOLREP (Vagin and Teplyakov, 2010) using 
the already solved DR2/MBP  structure  (PDB:  1BX2,  (Smith  et  al.,  1998))  as  a  search 
model. For structure refinement the program CNS (Brunger, 2007; Brunger et al., 1998) 
was used. Manual model building was carried out in O (Jones et al., 1991) and COOT 
(Emsley  and  Cowtan,  2004).  To  model  the  small  molecules  into  observable  electron 
density  coordinates  and  molecular  topologies  of  the  small  molecules  were  generated 

---