The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

25 
Chapter I 
with the Prodrg server (Schuttelkopf and van Aalten, 2004). To assess the accuracy of 
the crystal structure the statistical quantities R
free
 and R
work
 were used (Brunger, 1992).  
 
2.2.2
 
Preparation of isotope labeled MBP peptide 
The 15 amino acid peptide (ENSVVHFFKNIVTSR) was expressed as a C-terminal 
in-frame  fusion  to  the  trpLE  sequence  with  an  N-terminal  9-His  tag  in  the  pMM-LR6 
vector (gift  from  S. C. Blacklow, Harvard Medical  School,  Boston). The trpLE fusion 
protein (Staley and Kim, 1994) contains the E. coli trp leader polypeptide L, the E. coli 
trp polypeptide E with the deletion LE 1413 (Kleid et al., 1981; Miozzari and Yanofsky, 
1978) and the T7 promoter-operator sequence allowing high levels of transcription into 
mRNA  (Studier  et  al.,  1990).  Furthermore  the  trpLE  fusion  protein  directs  the 
expression of the protein into insoluble inclusion bodies which reduces toxicity.  
Transformed E. coli BL21(DE3) cells were inoculated into 1 L M9 minimal medium 
(1  liter:  4  g  glucose,  1  mL  2  M  MgSO
4
,  1  mL  0.1  M  CaCl
2
,  40  mL  Centrum 
multivitamins solution, 1 g NH
4
Cl, 6 g Na
2
HPO
4
, 3 g KH
2
PO
4
, 0.5 g NaCl) with one or 
more stable isotope labels.  Cultures  were grown at  37 ºC to an absorbance of ~ 0.6 at 
600 nm and were induced at 37 ºC with 300 μM isopropyl ß-D-thiogalactopyranoside. 
NH
4
Cl  and  glucose  of  the  M9  minimal  media  were  replaced  with 
15
NH
4
Cl  and 
13
C-
glucose  (Cambridge  Isotope  Laboratories),  respectively,  to  label  the  peptide  with  the 
stable  isotopes 
15
N  and 
13
C.  Deuteration  of  the  peptide  required  bacterial  growth  in 
D
2
O.  As  bacterial  growth  is  slow  in  D
2
O  the  level  of  D
2
O  was  gradually  adjusted  by 
transferring  the  bacterial  culture  from  media  prepared  with  50%  D
2
O  to  media  with 
80% and finally 100% D
2
O.  
Inclusion bodies were extracted with 6 M guanidine HCl, 50 mM Tris (pH 8.0), 200 
mM  NaCl,  1%  Triton  X-100,  and  5  mM  2-mercaptoethanol.  The  cleared  lysate  was 
bound  to  a  Ni
2+
-affinity  column  (Sigma)  and  washed  with  five  column  volumes  urea 
buffer  (8  M  urea,  50  mM  Tris,  pH  8.0,  200  mM  NaCl)  under  reducing  conditions  (5 
mM 2-mercaptoethanol) and five column volumes under non-reducing conditions. After 
additional washing with water the protein was eluted with pure formic acid. Water was 
added  to  the  eluted  protein  fractions  until  a  formic  acid  concentration  of  70%  was 
obtained.  As  a  methionine  had  been  introduced  between  the  peptide  sequence  and  the 
fusion protein, both components could be separated by chemical cleavage using CNBr. 
0.2  g  CNBr  for  every  1  mL  formic  acid/protein  solution  was  added  and  incubated  at 

---

26 
Chapter I 
room temperature  for 1  h with  exclusion of light and oxygen using a nitrogen stream. 
The cleavage rate was monitored using SDS-PAGE. 
CNBr was removed by dialysis against water using regenerated cellulose membranes 
(MWCO  1000  Da).  The  dialyzed  solution  was  neutralized.  After  precipitation  of  the 
cleaved  trpLE  fusion  partner  the  supernatant  which  contained  the  peptide  was  shock 
frozen using liquid nitrogen and subsequently lyophilized. The lyophilized peptide was 
dissolved  in  50%  TFA,  loaded  onto  a  C8  column  and  separated  on  a  gradient  of  5%-
95%  acetonitrile  (0.1%  TFA)  over  15  column  volumes.  The  purified  peptide  was 
identified  by  mass  spectrometry.  Peptide  fractions  were  lyophilized  and  dissolved  in 
water to prepare a 1 mM stock solution.  
 
2.2.3
 
Preparation of HLA-DR2/peptide complexes 
For  the  preparation  of  the  various  DR2/peptide  complexes  soluble  DR2/CLIP 
complexes  were  used  which  had  been  produced  using  stably  transfected  Chinese 
hamster ovary (CHO) cell lines in hollow fiber bioreactors as described in  (Day et al., 
2003).  Soluble  DR2/CLIP  proteins  were  purified  via  affinity  chromatography  with 
monoclonal  antibody  L243  (American  Type  Culture  Collection).  The  CLIP  peptide 
(PVSKMRMATPLLMQA) was  covalently attached via a thrombin-cleavable linker at 
the  N-terminus  of  the  DRß  chain.  After  thrombin  cleavage  (20  units  thrombin/1  mg 
protein,  2  h,  30  ºC)  the  cleaved  CLIP  peptide  was  exchanged  versus  the  respective 
peptide  synthesized  by  Peptide  2.0.  For  peptide  exchange  a  5-fold  molar  excess  of 
peptide was added to cleaved DR2/CLIP (0.2 mg/mL) in 50 mM citrate buffer (pH 5.2), 
100 mM NaCl and incubated overnight at 30 °C.  
During  the  preparation  of  DR2  complexes  carrying  isotope  labeled  MBP  peptides 
excess  peptide  was  removed  by  size  exclusion  chromatography  (Superose  6)  after  the 
peptide  exchange  reaction.  During  chromatography  the  complex  was  also  buffer 
exchanged  to  the  final  buffer  (10  mM  Tris,  pH  7.0,  100  mM  NaCl)  and  afterwards 
concentrated to the final concentration used for NMR experiments.  
To  prepare  unlabeled  DR2/MBP  complex  used  for 
19
F-NMR  experiments,  MBP 
peptide  was  synthesized  by  Peptide  2.0  with  a  DNP-label  at  the  side  chain  of  a  C-
terminal lysine. For peptide loading the protocol was followed as described above with 
the modification of adding 50 uM of the small molecule J10-1 to the peptide exchange 
reaction.  Free  peptide  was  removed  by  size  exclusion  chromatography  (Superose  12) 

---