The mechanism of peptide exchange by mhc II molecules

19 
Introduction 
Nicholson  et  al.,  2006).  By  tracking  fluorescence  polarization  of  a  labeled  peptide 
bound to soluble DR2 in the presence of soluble DM, four small molecules were found 
that  substantially  enhanced  peptide  exchange  (10
-6
  –  10
-4
  M).  Two  of  the  small 
molecules  also  showed  activity  in  the  absence  of  DM  although  to  a  smaller  extent. 
Microdialysis  experiments  indicated  direct  binding  to  DM  for  one  of  the  small 
molecules  (M19,  see  table  1.1)  being  active  only  in  the  presence  of  DM.  Binding  to 
both proteins, DM and DR2, was observed for a small molecule (F15, see table 1.1) that 
showed activity even without DM. Furthermore, three of the four small molecules were 
sensitive to DM mutations localized at the hydrophobic ridge at the top of the concave 
side  of  DM,  which  is  very  likely  part  of  the  interaction  surface  of  DM  and  DR  (see 
figure  1.7),  indicating  that  some  of  the  small  molecules  may  support  the  DM-DR 
interface by contacting residues of both proteins.  
 
J10 and its analogs 
Among  the  most  potent  loading  enhancers  of  MHC  II  molecules  acting  in  the 
absence of DM are J10 and its analogs discovered by Wucherpfennig and colleagues by 
a high-throughput screening (Call et al., 2009). The J10 series of molecules is active on 
all  tested  DR  alleles  (DR1,  DR2,  DR4)  and  showed  no  sensitivity  to  polymorphism 
involving  the  P1  pocket,  suggesting  the  peptide  exchange  mechanism  of  J10  may  be 
distinct from the mechanism of the di-peptides and the adamantyl compounds described 
above. Extensive medicinal chemistry improved the activity of the small molecules used 
at  a  concentration  of  10
-5
  –  10
-4
  M  and  enhancement  of  peptide  presentation  has  been 
demonstrated both in vitro in a cellular assay and in vivo. 
 
In  general,  MLE  are  remarkably  diverse  and  might  use  distinct  mechanisms  to 
influence  peptide  exchange.  However,  it  is  likely  that  the  small  molecules  interfere 
either  directly  or  allosterically  with  one  of  the  two  main  interactions  between  peptide 
and  MHC  II  molecules,  i.e.  conserved  hydrogen  bond  network  between  peptide  and 
MHC II residues and occupancy of a series of deep pockets formed by MHC II residues. 
During  these  studies,  the  peptide  exchange  mechanism  of  J10  and  its  analogs  was 
investigated  in  the  absence  of  DM  applying  X-ray  crystallography  and  NMR 
spectroscopy as can be seen in chapter I. The J10 series of small molecules has a strong 
potential for use as adjuvant for peptide vaccination and in therapeutics due to the low 
concentration needed for activity and showed already promising results in vivo.  

---

20 
Introduction 
Table  1.1:  MHC  loading  enhancers  (MLE).  MLE  are  small  molecules  that  influence  peptide-
binding by MHC II  molecules. Representative  structures  from each reference are  shown. (adapted from 
(Call, 2011)). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

---

21 
Introduction 
1.9
 
Scopes and objectives of this study  
This  doctoral  work  aimed  to  elucidate  molecular  details  of  the  peptide  exchange 
mechanism of MHC II molecules catalyzed by the protein DM and the synthetic small 
molecule  J10.  To  address  structural  and  dynamic  aspects  of  this  complex  process 
various  methods  were  applied  including  surface  plasmon  resonance  (SPR),  X-ray 
crystallography and NMR spectroscopy. 
 
Surface plasmon resonance experiments were carried out to investigate DM binding 
to  high-affinity  MHC II/peptide  complexes.  Recent  studies  have  shown  that  for  DM 
binding  to  occur,  the  N-terminal  part  of  the  peptide  has  to  leave  the  binding  groove. 
This  partial  peptide  release  could  be  due  to  spontaneous  peptide  motion  which  should 
be  enhanced  at  higher  temperature  and  implies  DM  binding  to  all  MHC II/peptide 
complexes  even  if  to  a  small  extent.  To  test  this  hypothesis  SPR  experiments  were 
carried out at different temperatures investigating whether DM binding can be induced 
to  high-affinity  MHC II/peptide  complexes  previously  exhibiting  no  or  only  little  DM 
susceptibility. 
 
Crystallographic  studies  were  applied  to  reveal  the  MHC II  conformation  with  a 
partially  empty  peptide-binding  groove,  which  could  determine  whether  release  of  the 
peptide N-terminus induces conformational changes of the MHC II structure. Knowing 
how the MHC II conformation adapts to loss of crucial interactions between peptide and 
MHC II  molecule  could  display  important  molecular  details  of  the  peptide  exchange 
mechanism. Furthermore, using X-ray crystallography we aimed to identify the binding 
site  of  the  small  molecule  J10,  which  would  allow  structure  based  design  to  further 
improve affinity and activity of the MHC loading enhancer J10.  
 
Applying  NMR  spectroscopy,  the  dynamics  of  the  peptide  bound  to  MHC II 
molecule  were  explored  in  solution.  To  date,  the  molecular  understanding  of  the 
MHC II/peptide  complex  is  mainly  deduced  from  the  static  image  given  by  crystal 
structures.  Investigating  MHC II/peptide  complexes  in  solution  could  advance  this 
understanding  by  taking  the  dynamics  of  the  complex  and  especially  peptide  mobility 
into account.  Furthermore, using the  NMR  approach,  peptide  release facilitated by the 
small  molecule  J10  was  followed  in  solution  to  explore  the  peptide  exchange 
mechanism catalyzed by J10.  

---