Masarykova univerzita přírodovědecká fakulta

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí

Hodnocení genotoxického potenciálu UV filtru

Diplomová práce

Anežka Nečasová

VEDOUCÍ PRÁCE: RNDr. PAVEL ČUPR, Ph.D.

BRNO 2013

Bibliografický záznam

Autor:	Bc. Anežka Nečasová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
Název práce:	Hodnocení genotoxického potenciálu UV filtru
Studijní program:	Chemie
Studijní obor:	Chemie životního prostředí
Vedoucí práce:	RNDr. Pavel Čupr, Ph.D.
Akademický rok:	2012/2013
Počet stran:	85
Klíčová slova:	Genotoxicita, UV filtry, EHMC, fotoisomerizace, optické isomery, UmuC test, SOS Chromotest

Bibliographic Entry

Author	Bc. Anežka Nečasová Faculty of Science, Masaryk University Research Centre for Toxic Compounds in the Environment
Title of Thesis:	Evaluation of the genotoxicity of UV sunscreen
Degreeprogramme:	Chemistry
Field of Study:	Chemistry of environment
Supervisor:	RNDr. Pavel Čupr, Ph.D.
Academic Year:	2012/2013
Numberof Pages:	85
Keywords:	Genotoxicity, UV filters, EHMC, photoisomerisation, optical isomers, UmuC test, SOS Chromotest

Abstrakt

UV filtry používané v kosmetických přípravcích jsou denně aplikovány na kůži zejména v letních měsících pro ochranu před škodlivým UV zářením, proto je důležité se zabývat jejich případnými biologickými efekty a znát jejich mechanismy působení. V řadě studií bylo prokázáno, že některé UV filtry, patřící paradoxně mezi nejpoužívanější aktivní složky opalovacích krémů, působí na endokrinní systém. Mezi tyto UV filtry patří také EHMC (transEHMC isomer), který na světle podléhá fotodegradaci, při níž vzniká méně stabilní optický isomer cisEHMC. Toxikologické studie se doposud zabývaly jen isomerní formou transEHMC a informace o fotoproduktu cisEHMC chybí. Tato diplomová práce se zabývá hodnocením rozdílných odpovědí obou isomerů ve vybraných testech toxicity. Jelikož cisEHMC není dostupný jako standard, bylo nutné vyvinout metodiku ozařování EHMC pomocí UV světla a metodu separace cisisomeru z ozářené směsi. Z důvodu ověření přesných koncentrací v průběhu testování byly isomery cis i trans analyzovány pomocí GCFID. Byla vyvinuta metodika separace cisEHMC, kdy bylo dosaženo velmi vysokého výtěžku cisisomeru o čistotě více než 98 %. CisEHMC byl testován spolu se standardem EHMC na modelech genotoxicity UmuC test a SOS Chromotest. Cílem práce bylo také zavést inovovanou metodu UmuC testu s použitím substrátu CPRG do laboratoře RECETOX. CisEHMC a standard EHMC byl rovněž testován na estrogenní aktivitu na buňkách MVLN a HeLa9903. V testech estrogenity nebyl estrogenní potenciál EHMC potvrzen. Standard EHMC a izolovaný cisisomer vykázaly rozdílné odpovědi v testech genotoxicity. Je tedy potřeba se této látce věnovat v dalších studiích.

Abstract

UV filters used in cosmetic products are applied to the skin daily in the summer months to protect against harmful UV rays, so it is important to consider the biological effects and know their mechanisms of action. a number of studies have shown that some UV filters, paradoxically the most widely used sunscreens, have an influence on the endocrine system. Among these UV filters belong also EHMC (trans isomer EHMC) that is subject to photodegradation under UV light and in this process is created less stable optical isomer cisEHMC. Toxicological studies have examined only isomeric form of transEHMC and information about photoproducts cisEHMC is missing. This thesis deals with the evaluation of different responses of the two isomers in selected toxicity tests. Since cis EHMC is not available as a standard, it was necessary to develop a methodology EHMC irradiation with UV light and the method of separation of cisisomer from the irradiated mixture. In order to verify the exact concentrations during the testing were the isomers cisand trans analyzed by GCFID. It was developed methodology separation of cisEHMC, achieving a very high yield of cisisomer with a purity of more than 98%. Cis EHMC was tested together with the standard model of EHMC on two models of genotoxicity: UmuC test and SOS Chromotest. The aim of this thesis was to introduce to the laboratory RECETOX an innovative method of UmuC test using the substrate CPRG to the. CisEHMC and standard of EHMC was also tested for estrogenic activity in cells MVLN and HeLa9903. In the tests of estrogenicity wasn’t confirmed the estrogenic potential EHMC. Standard of EHMC and isolated cisisomer showed different responses in tests of genotoxicity. It is therefore necessary to devote to this substance in further studies.

Poděkování

Děkuji svému vedoucímu, RNDr. Pavlu Čuprovi, Ph.D. za trpělivé vedení mé diplomové práce, za jeho velkou motivaci a odborné rady, děkuji doc. RNDr. Zdeňku Šimkovi, Csc. a Mgr. Jaromíru Literákovi, Ph.D. za pomoc při realizaci analytické části experimentů. Velký dík patří také Mgr. Jiřímu Novákovi, Ph.D. za pomoc při realizaci toxikologických experimentů.

Ze srdce děkuji svým rodičům a blízkým, kteří mě ve studiu nesmírně podporují.

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 15. května 2013

……………………………… Anežka Nečasová

OBSAH

Seznam zkratek 9

1.Úvod 11

1.Cíle diplomové práce 13

2.Teoretická část 14

1.2.UV záření 14

1.2.1.Vlivy UV záření 14

1.2.1.1.Kůže 14

1.2.1.2.Působení UV záření na pokožku 15

1.2.1.3.Trendy v opalování 15

1.2.1.4.Příznivé působení UV záření 15

1.3.UV filtry a jejich vlastnosti 16

1.3.1.Sun Protection Factor 16

1.3.2.UV filtry a jejich rozdělení 16

1.3.2.1.Chemické (organické) filtry 17

1.3.2.2.Organické nerozpustné pigmenty 18

1.3.2.3.Minerální (anorganické) UV filtry 18

1.4.Ethylhexyl methoxycinamát 19

1.4.1.Toxicita EHMC 20

1.4.2.Karcinogenita, genotoxicita EHMC 21

1.4.2.1.Genotoxicita – vymezení pojmů 22

1.4.3.Imunotoxicita a alergenní potenciál EHMC 24

1.4.4.Testy EHMC laboratoře EnTox 25

1.4.4.1.Test imunotoxicity 26

1.4.4.2.Estrogenní potenciál EHMC 26

1.5.Fotoisomerizace EHMC a jiných UV filtrů 28

1.5.1.Fotostabilita a reakční kinetika 29

1.5.2.Fytotoxicita 30

1.6.Penetrace sunscreenů přes pokožku 31

1.7.Produkce reaktivních forem kyslíku v souvislosti se sunscreeny 35

1.8.Potenciální rizika pro vodní prostředí 35

1.9.Zajímavé poznatky o opalovacích krémech 36

3.Materiály a metody 39

1.2.Chemická analýza UV filtrů 39

1.2.Ozařování UVlampou 39

1.3.Analýza fotoproduktu 39

1.3.1.Plynová chromatografie 39

1.4.Metody separace 40

1.4.1.Chromatografie na tenké vrstvě 40

1.4.2.Sloupcová kapalinová chromatografie 40

1.5.Použité bakteriální kultury v testech genotoxicity 41

1.5.1.Escherichia coli 41

1.5.1.1.Escherichia coli K12 41

1.5.2.Salmonella Typhimurium 41

1.6.DMSO a jeho vliv na buněčnou membránu 42

1.7.SOS Chromotest 42

1.7.1.Příprava zamražené kultury 43

1.7.2.Provedení testu 44

1.7.2.1.Příprava médií 44

1.7.2.2.Pracovní postup 45

1.7.2.3.Zpracování výsledků 46

1.7.3.Porovnání citlivosti SOS Chromotestu v mezilaboratorní studii 47

1.8.UmuC test 50

1.8.1.Příprava zamražené kultury 51

1.8.2.Provedení testu 51

1.8.2.1.Příprava médií 51

1.8.2.2.Pracovní postup 53

1.8.2.3.Zpracování výsledků 54

1.8.2.4.Validace testu 56

1.9.Testy estrogenního potenciálu 56

1.9.1.Test na buněčných liniích MVLN 56

1.9.2.Test na buněčných liniích HeLa9903 56

4.Výsledky a diskuze 58

1.2.Ozařování a fotoprodukty látky EHMC 58

1.3.Separace cisisomeru 59

1.3.1.Chromatografie na tenké vrstvě 59

1.3.2.Kolonová chromatografie 61

1.4.SOS Chromotest a UmuC test na cisEHMC a standardu EHMC 62

1.4.1.SOS Chromotest 62

1.4.2.UmuC test 64

1.5.Test estrogenity cisEHMC a standardu EHMC na buněčných liniích MVLN 67

1.6.Test estrogenity cisEHMC a standardu EHMC na buněčných liniích HeLa9903 68

1.7.Analýza rizik EHMC a dalších sunscreenů 69

1.7.1.Výpočet CDI (Chronic Daily Intake) 69

1.7.2.Výsledky a diskuze analýzy rizik 71

1.7.2.1.EHMC 71

1.7.2.2.4MBC 73

1.7.2.3.BP3 75

5.Závěr 79

6.Použitá literatura 81