9-10-Amaliy mashg’ulot Mikrob kulturasi turini aniqlash uchun bakteriofagdan foydalanish va fagotiplash. Turli antibiotiklarni namoyish etish. Mikroorganizmlarning sezgirligini disklar usulida va ketma-ket suyultirish usulida aniqlash

9-10-Amaliy mashg’ulot
Mikrob kulturasi turini aniqlash uchun bakteriofagdan foydalanish va fagotiplash. Turli antibiotiklarni namoyish etish. Mikroorganizmlarning sezgirligini disklar usulida va ketma-ket suyultirish usulida aniqlash.
Talaba bajara olishi kerak:
1. Mikrob kulturasining bakteriofagga sezgirligini aniqlash.
2. Ajratib olingan sof kulturaning antibiotiklarga sezgirligini disklar usulida aniqlash.
Bakteriofagdan m ikroorganizm larning xu susiyatini o ‘rganish usullari
Fransuz olimi d ’Errel 1917-yilda dizenteriyadan tuzalgan bemorning najasi filtrati, shu turga kiruvchi bakteriyani bulonda yemirish xususiyatiga ega ekanligini kuzatadi. Bu yemirish mikrob yig‘imini lizisga uchratish, ya’ni mikrob hujayrasini eritish natijasida ro'y beradi.
d ’Errel mikrob hujayrasini eritish xususiyatiga ega bo'lgan agentni bakteriofag, bu holatni esa bakteriofaglash fenomeni deb atagan. Keyinchalik bakteriofag jarayonini o'rganish natijasida shu narsa m a’lum bo'ladiki, bakteriofag viruslarning bir turi bo'lib, bakteriyalarni yemirish va yo'qotish xususiyatiga ega pkan. Bakteriofaglash jarayoni quyidagi bosqichlarda boradi:
1. Mikrob hujayrasi yuzasiga yopishishi;
2. Fagning mikrob hujayrasiga kirishi;
3. Bakterial hujayra ichida fag donachalarining hosil bo'lishi;
4. Hujayraning yemirilishi va faol fag donachasining ajralib chiqishi.
Fagotiplash va fagotiplash usullari
Bakteriofaglarning ijobiy xususiyatlaridan biri bakteriyalar turini to'g'ri aniqlashda indikatorligi hisoblanadi. Shuning uchun ham ushbu usuldan bakteriyalarni identifikatsiyalashda keng foydalaniladi.
Kredji va Iyensen usuli bo’yicha mikroblarni fagotiplash. Bu usul asosida kultura turi bilan bakteriofag turini birgalikda o'stirish yotadi. Lizis ro'y berishi indikator belgi hisoblanadi, bu yo'l bilan bakteriyaning qaysi turga kirishi aniqlanadi. Fagotiplash uchun yaxshi quritilgan 1,5 litr go'sht, oqsilli agar h am d a 5 % li glitserin kerak bo'ladi.
Bir kecha-kunduzda o'rganiladigan shtammning agarli kulturasi bulonga ekilib 37°C li termostatga qo'yiladi. Yaxshi o'sish belgilari ko'rinib qolgandan so'ng, shtamm ingichka uchli Paster tomizgichi bilan olinib, yaxshi qurigan qattiq oziqli muhit yuzasiga tomiziladi. Tomchini oziq muhitga joylashtirishni oldindan belgilab olish ham mumkin. Buning uchun oziq muhitning markaziy qismida steril bakterial probirka tubi bilan yarimoysimon chuqurcha tayyorlab olinadi. Shunday qilib, tomchining joyi ham aniq bo'lib va kulturani oziq muhitning boshqa qismlariga tarqalishining oldi olinadi. Tomchilar soni faglar soniga to'g'ri kelishi kerak h am da 1 tom chi kulturaning o'sishiiji nazorat qilish uchun tomiziladi. Kultura tomchilari so‘rilishiga 3— 10 daqiqa vaqt ketadi. So'ng har bir tom chi ustidan ekssentrik holdagi 1 tom chi fag tip i sh u n d ay hisobda to m iz ila d ik i, bu n d a kulturaning ayrim qismlari erkin qolishi, bakterofag esa ta ’sir qilmasligi kerak. Kulturani bakteriofag tomizilmagan qismi uning o ‘sishini nazorat qilish u ch u n kerak b o 'lad i. T ajribani q o ‘yishda h ar b ir turdagi bakteriofag uchun alohida tomizgich ishlatiladi. Bunda bakteriofag qattiq oziq muhitda aniq kulturaning yemirilishini keltirib chiqaradi. Lekin geterologik qatordagi tip kulturalarni yemirmaydi. Bakterofag oziq m uhitga so‘rilishi bilan ekm a kosachasi 37°C li term ostatga joylashtiriladi, 6—8 soat o 'tg ach esa fagotiplanishning hisob-kitobi qilinadi. Fagotiplashni tushib turuvchi yorug'likdan ham , o ‘tuvchi yorug‘likdan ham o'tkazish m um kin. A m aliyotga b ak terio fag d an : 1) bakteriya fagoti pini aniqlash (ya’ni, fagotip bir turdagi bakteriya shtammini shu tipgaxos faglar bilan lizislash orqali aniqlanadi; bu esa tekshirilayotgan kulturani belgilashda, kasallikni epidem iologik tekshirishda ayniqsa rnuhim dir); 2) fagodifferensatsiyalash fag yordamida bakteriya kulturasini qaysi turga m ansubligini an iq lash ; 3) fagodiagnostika — b em o r organizmidan (masalan, najasdan) fagni ajratib olishda foydalaniladi. Bu organizm da shu fagning mikrobi borligini ko'rsatadi, ya’ni fag bilan tashxis qo'yish; 4) fagoprofilaktika — epidemik o 'c h o q d a bo'lgan kishilar orasida ayrim kasalliklarning oldini olish (m asalan, dizenteriya); 5) fagoterapiya — ayrim yuqumli kasalliklarga uchragan b e m o r n i u sh b u k asa llik n i k e ltirib ch iq arg an sh ig e lla , p ro te y , , stafilokokk, ko'k yiring tayoqchasi kabi bakteriyalarga qarshi davolashda ishlatiladi. M ikroblarning antibiotikka sezgirligini aniqlash Antagonizm holati mikroblar olamida keng tarqalgan.Bu holat mikroblarning o'zaro birga yashay olmasligini bildiradi, ya’ni binning ko'payishi ikkinchisining halokatiga sabab bo'ladi. Masalan, tanamizdagi mikroblar patogen va bijg'ituvchi mikroorganizmlarga antagonistik t a ’sir ko'rsatadi. M ikroblarni antagonistik t a ’sirini o'rganish maxsus antibakterial modda yaratilishiga sabab bo'ladi. Bu moddalarni bakteriyalar hamda zamburug'lar ishlab chiqaradi. Ular antibiotiklar deb ataladi (yunon. anti — qarshi, bios — hayot demakdir). Hozirgi kunda bakteriyalardan, zamburug'lardan va aktinomitsetlardan ajratib olingan antibiotiklar keng foydalaniladi. Antibiotiklar — b a’zi m ikroorganizm lar (aktinomitsctlar, zam - b u ru g 'la r va bakteriyalar), hayvon to'qim alari va ayrim o ’simliklar hayot faoliyati natijasida hosil boMadigan va turli xil mikroblarning o ‘sishi h am d a rivojlanishini to ‘xtatadigan organik m oddadir. Bu term in n i A m erika olim i Z .V aksm an m ik ro b lard a hosil b o ‘lib, b o s h q a m ikroblarga qarshi t a ’sir etad ig an m o d d alarg a nisbatan taklif etgan. Antibiotiklar kasallantiruvchi (patogen) mikroblarda moddalar almashinuvini buzib, ularni oMdiradi yoki o ‘sishini to ‘xtatadi. Ular turli mikroblarga turlicha ta ’sir etadi. M asalan, bir antibiotik m a ’lum bir mikrobga kuchli ta ’sir etgani holda, boshqasiga kuchsiz t a ’sir qiladi yoki butunlay ta ’sir qilmaydi. K o 'p g in a antibiotiklar faqat mikroblarni emas; balki odam , hayvon va o ‘simlik organizmini (to‘qima va hujayralarni) ham yemiradi. Shuning uchun tibbiyot am aliyotida uning faqat zararli m ikroblarni o ‘ldiradigan, am m o o d a m , hayvon va o ‘simlik organizm ini yem irm aydigan turlarigina ishlatiladi. Birinchi antibiotik modda (tirotritsin)ni 1939-yilda Dyubo tuproqda yashovchi Bacilus brevis deb ataladigan bakteriyadan olgan. 1941 -yilda ingliz olimi X.Flori bilan A .Flem ing m o g ‘or zamburug*i ( Penicillinum notatum)ning bulon filtratidan pcnitsillin, G.F. Gauze va M.T. Brajnikova 1942-yilda tuproq bakteriyalardan gramitsidin, Z .A .V aksm an 1944-yilda S trep to m yc es g riseu s zam burug'idan streptomitsinni ajratib olishga muvaffaq bo ‘ldilar. Antibiotiklar kelib chiqishi, kimyoviy tarkibi, antimikrob ta ’sir doirasiga ko‘ra tasniflanadi. Kimyoviy tarkibi b o ‘yicha antibiotiklar quyidagi guruhlarga bo‘linadi: 1. Betalaktamli antibiotiklar yoki betalaktam idlar — betalaktam halqali azot tutuvchi geterosiklik birikmalar. Bularga quyidagilar kiradi: penitsillin guruhi — tabiiy benzilpenitsillin va yarim sun’iy penitsillin (metatsillin, oksatsillin, ampitsillin, karbenitsillin) va sefalosporin (sefazonin, sefaloridin, kefzol, klofaran va b.). 2. Tetratsiklin va uning yarim s u n ’iy hosilalari: oksitetratsiklin, xlortetratsiklin, morfotsiklin, metatsiklin, dioksitsiklin, vibromitsin. B ular har xil radikallar tutuvchi to ‘rtta benzol halqadan tashkil topgan. 3. Aminoglikozidlar — streptomitsin guruhi va dezoksistrcptamin tutuvchi aminoglikozid antibiotiklar. Streptomitsin guruhiga streptomitsin sulfat hamda streptidin, streptozlar va N-metilglukozamindan tashkil topgan uning hosilalari kiradi. Dezoksistreptamin tutuvchi aminoglikozid antibiotiklarga: neomitsin, m onom itsin, kanam itsin, amikatsin, pentamitsin, tobramitsin va boshqalar kiradi. 4. Makrolidlar — makrotsiklik lakton halqa tutuvchi birikmalar (eritromitsin, oleandomitsin). 5. Levomitsetin (tabiiy turi xloramtenikol) sun’iy modda bo'lib, tarkibiga nitrofenil, dixloratsetamin, propandiol kiradi. 6. Rifapitsinlar. Bu guruhga tabiiy antibiotik — rifamitsin va uning yarim sun’iy hosilasi — rifampitsin kiradi. Bular murakkab kimyoviy tuzilishga ega b o ‘lib, makrotsiklik halqasi bor. 7. Poliyenli antibiotiklar — nistatin, levorin, amfoteritsin B. Bular bir qancha tutashgan qo'shbog'larga ega. Antimikrob t a ’sir mexanizmi b o ‘yicha antibiotiklar bir-biridan farq qiladi. Antibiotiklar mikroorganizmlarga, asosan, bakteriyalarga bakteriostatik yoki bakteritsid t a ’sir k o ‘rsatadi. Bakteritsid t a ’sirga ega bo'lgan antibiotiklarga benzilpenitsillin va uning yarim su n ’iy hosilalari, ham m a sefalosporinlar, aminoglikozidlar, rifamitsinlar kiradi. Bakteriostatik ta ’sirga ega bo'lgan antibiotiklarga esa levomitsetin, tetratsiklin, makrolidlar kiradi. B a’zan bakteriostatik ta’sirga ega bo'lgan antibiotiklar uzoq vaqt qabul qilinganda m ikroorganizm larga o'ldiruvchi t a ’sir ko'rsatadi. Antimikrob ta ’sir doirasi bo'yicha antibiotiklar ikki guruhga (tor va keng ta ’sir ko'rsatuvchi) bo'linadi. Tor ta ’sir doirali antibiotiklar faqat bir guruhdagi mikroblarga, masalan, benzilpenitsillin yiring paydo qiluvchi kokklarga, b a ’zi bir garam m usbat bak teriy a va spiroxetalarga, poliyen guruhiga kiruvchi antibiotiklar (nistatin, levorin, amfoteritsin B) esa m a ’lum bir zamburug' va sodda jonivorlarga t a ’sir qiladi. Keng t a ’sir doirali a n tib io tik la r bir necha g ra m m u sb a t va grammanfiy bakteriyalarga, masalan, rikketsiya, xlamidiy, mikoplazma va boshqalarga antimikrob ta ’sir ko'rsata oladi. Bunday ta ’sir doirasiga ega antibiotiklarga tetratsiklin, levomitsetin, am inoglikozidlar, makrolidlar, rifampitsin, sefalosporinlarning 3—4-avlodi mansub. Laboratoriya tekshirishlarida mikroorganizmlarning sezgirlik darajasi antibiotikning minimal konsentratsiyasi bilan belgilanadi. Antibiotiklarga sezgirligi bo'yicha mikroorganizmlar to'rt guruhga bo'linadi: 1. Sezgir — oddiy dozalari natija beradi. 2. 0 ‘rtacha sezgir — yuqori dozadagi vositalar ta ’sir qiladi. 3. Chidam li — infeksiya o 'ch o g 'ig a ta ’sir qilinsagina antibiotik samara beradi. 4. Juda chidam li —antibiotiklar samara bermaydi. M ikroorganizmlarning antibiotiklarga sezgirligi diffuz agarda standart qog'oz doirachalar va ketm a-ket suyultirish usuli bilan aniqlanadi. Standart qog'oz doirachalar bilan sezgirlikni aniqlash. Standart q og'oz d o irach alar hajmi 5 m m keladigan maxsus filtr qog 'o zid an tayyorlanadi. Qog'oz doirachalar antibiotik bilan to'yintirilgan bo'lib, ular bir xil konsentrasiyaga ega va m ikroblarning o'sishini bir xil hajmdagi diametrda to'xtatish xususiyatiga ega bo'Iadi. Ishlashga qulaylik tug'dirish uchun ular har xil rangga bo'yaladi (31 -rasm ). Tajriba q o ‘yish texnikasi. Sterillangan Petri kosachalari gorizontal holatda tekis qilib qo'yiladi va unga 2 % li go'sht-oqsilli agar (pH 7,2—7,4 bo.'lgan)dan 20 ml quyiladi. Bu agarda o'smaydigan mikroblar uchun 5 % qonli yoki zardobli agar qo'llanadi. Ekishdan oldin kosachalar termostatda quritiladi. Ekish uchun 18—20 soat davomida bulonda yoki agarda o'stirilgan kultura olinadi. Q u ritilgan oziq m u h it yuzasiga 1 ml m ik ro b kulturasi solinadi. Kosachalarni harakatlantirish bilan kultura oziq muhit yuzasiga tekis qilib yoyiladi va ortiqchasi tomizgich bilan so'rib olinadi. Ekilgan kosachalar xona haroratida 30—40 daqiqa quritiladi, keyin o 'tk ir uchli qisqich bilan unga qog'oz doirachalar joylashtiriladi. Doiracha yaxshi joylashishi uchun ularni qisqich bilan bosib-bosib qo'yiladi. Q o g 'o z d o i r a c h a l a r k o s a c h a c h e k k a s s id a n 2 — 2,5 sm n a r id a joylashtiriladi. Doirachalar oralig'i ham bir xil bo'lishi kerak. H ar bir kosachaga 5 tadan 8 tagacha doiracha joylashtirish mumkin. Ekilgan va doirachalar joylashtirilgan kosachalarni 18 soat 37°C li termostatga tubi yuqoriga qilib joylashtiriladi. Antibiotikka sezgir bakteriyalar atrofida o'sish susaysa, mikroblar o'sgan joydan ajralib turadi. Ajralib turgan u joy diam etri m illim etrli ch izg 'ich bilan o'lchanadi. Chizg'ich doiraning markazidan o'tishi kerak. Agar o'sish to'xtagan so h an in g diam etri 10 m m b o'lsa, ushbu b ak teriy an in g sezgirlik darajasi past deb hisoblanadi, mabodo undan yuqori bo'lsa sezgir hisoblanadi. Qog'oz doirachalar bir antibiotikning turli dozalari b ila n to 'y in tirilg a n b o 'ls a , u h o ld a te k s h irila y o tg a n b a k te r iy a kulturasining sezgirligi antibiotikning eng kichik dozasi hisobida olinadi. Ketm a-ket suyultirish usuli bilan mikroblarning antibiotiklarga sezgirligini aniqlash. Bu usul bilan bakteriyalarning antibiotikka sezgirligining pastligi aniqlanadi. Buning uchun aw alo antibiotikning asosiy eritmasi tayyorlab olinadi. S h u n d a n s o 'n g b u lo n d a (1 ml hajm da) keyingi eritm alar ham tayyorlanadi, so'ngra har bir probirkaga (0,1 m l.dan) tark ib id a 1 m l.d a 1 0 -6 -1 0 -7 b ak teriy a hujayrasi bo'lgan suyuqlik qo'shiladi. Oxirgi probirkaga 1 ml b u lo n va 0,1 ml bakteriya suspenziyasi (kulturani nazorat qilish uchun) quyiladi. Ekilgan probirkalar 37°C li te rm o sta td a 1 kun saqlanadi. Quyuq o'sgan oziq muhit nazorat kulturasiga solishtiriladi va tajriba natijasi aniqlanadi. Oxirgi probirkadagi oziq muhit tiniq va yaltiroq bo'ladi, bu tekshirilayotgan bakteriya kulturasi o'sishini juda kam dozadagi antibiotik to'xtalganini ko‘rsatadi.