Diplomová práce

14.3.1 Materiál a metodika
Byla použita metodika popsaná v práci Kearns et Inouye (1993). Bylo používáno barvení trifenyl tetrazolium chloridem, který barví životaschopná pylová zrna na základě jejich enzymatické aktivity do červena (až fialova). Jako vhodný se ukázal být roztok připravený podle Stanley (1974) (použit byl ale nakonec 0,1 M, nikoli 0,15 M tris-HCl pufr). Používány byly květy v samičí až samčí fázi, v případě samčí fáze pokud možno květy sáčkované, pro zabránění kontaminace pylem jiné rostliny opylovači (i v případě analýzy pylu nesáčkovaných květů jsem nepředpokládal výrazné ovlivnění výsledků vzhledem k předpokládanému minimálnímu množství kontaminujícího pylu ve vzorcích). Na fáze ontogeneze květů byl brán zřetel, neboť vitalita pylu z prašníků již otevřených (zvláště v případě několika dní vyprášeného pylu) a ještě uzavřených se mohla významně lišit (viz dále).

Postup:
1) Připravíme 1% roztok 2,3,5-TTC v 0,1 M tris-HCl pufru, 12% sacharosa, pH 7,8 (lze skladovat v chladu až tři měsíce)

2) Na podložní sklíčko nakápneme kapku roztoku TTC. Do kapky vložíme květní tyčinku a prašníky podrtíme (zavřené prašníky) nebo jen 'vymácháme' (prasklé prašníky) a kapku s pylem promícháme (zajištění homogennosti vzorku). Tyčinky odstraníme (na každý vzorek použijeme dvě) a vzorky přikryjeme krycím sklem (na každém podložním skle uděláme dva vzorky). Preparát (podložní sklo se dvěma vzorky přikrytými krycími skly) dáme do Petriho misky s navlhčeným filtračním papírem (vlhké prostředí zabraňuje vysychání preparátu) a necháme 3 hodiny inkubovat v temnu, při pokojové teplotě (pyl se začíná barvit téměř okamžitě, ale získaná data z nedobarveného pylu nejsou přesná a lze rozlišit méně kategorií vybarvenosti pylu).

3) Vzorky jednoho preparátu vyhodnocujeme pod mikroskopem (zvětšení asi 200-500x, podle hustoty pylových zrn) dokud nespočítáme řádově několik set různě vybarvených a nevybarvených pylových zrn (viz tabulky 14.3.2a,b,c).
Při vyhodnocování byly rozlišovány 3-4 kategorie různě vybarvených/nevybarvených zrn. Kraje vzorků k počítání příliš vhodné nejsou, neboť se zde častěji shlukovala pylová zrna málo vybarvená. Preparát s obarveným pylem je možno skladovat ve vlhkém prostředí i několik dní (zbarvená pylová zrna si svoje zbarvení zachovávají, neobarvená nevitální zrna se dodatečně nijak nezbarvují).

Obrázek 14.3.1a Obrázek 14.3.1b

Obrázek 14.3.1a - barvení TTC po 2 hodinách (M. obovata)

Obrázek 14.3.1b - fialově, červeně zbarvené a nevybarvené pylové zrno

Fotografie byly pořízeny v polarizovaném světle, další jsou k dispozici v 'multimedium-pruhoniciana-vitalita pylu'

14.3.2 Výsledky testování vitality pylu
V roce 2002 se dostatečně neodlišovaly fáze ontogeneze květů a klasifikována byla pylová zrna fialově zbarvená (fialová alespoň z 50% vybarvení zrna - velmi vitální pyl), červeně zbarvená (červená z více než 50% vybarvení zrna + zrna z více než 50% nevybarvená, ale významnou část zaujímá fialové zbarvení- pyl vitální) a neobarvená (vybarvení nedosahovalo ani 50%, pylová zrna poškozená či deformovaná - pyl nevitální). Pomocí těchto tří kategorií vybarvení pylu bylo možno zkušebně prokázat sníženou vitalitu pylu M. x soulangeana proti M. liliiflora 'Nigra', pěstovaných na nádvoří průhonického zámku. Rozdíl mezi preparáty z ještě neprasklých prašníků v obsahu nevybarvených zrn byl již na první pohled - M. liliiflora zhruba 20%, M. x soulangeana asi polovina zrn v preparátu. Tento výsledek bylo možno předvídat, neboť M. x soulangeana má hybridní původ a pravděpodobný počet chromozomů 2n=5x=95 (stupeň ploidie konkrétní rostliny nebyl zjištěn).

Vyhodnocení vzorků M. obovata a křížence s M. tripetala již vycházelo ze spočítaných 200-500 pylových zrn/preparát. Při stejné metodice jako u předchozích druhů vycházel obsah velmi vitálních a vitálních zrn u M. obovata proti kříženci poněkud vyšší, interpretace růžově vybarvených pylových zrn se však během počítání změnila (nevybarvené x červené pylové zrno).

Někdy je obtížné udržet stejné hodnocení jednotlivých kategorií pylu mezi vzorky. Zatímco velmi vitální pyl se barví do fialova a červená pylová zrna jsou dávána do další kategorie, u pylu málo vitálního jsou červená pylová zrna nezřídka započtena do pylu první skupiny a slabě obarvená zrna do druhé skupiny.

V roce 2003 bylo možno analyzovat pyl rostlin F2 generace křížence Magnolia obovata x M. tripetala rostoucích v pražské ZOO (svíčkové květy) a křížence neznámého původu 7/31. Vitalita pylu těchto rostlin byla srovnávána s vitalitou rodičovských druhů. Pro velký rozptyl dílčích výsledků nějaký kvalifikovaný závěr být udělán nemohl. Pylová zrna fialová (velmi vitální pyl) se u F2 vyskytoval od 10 do 55%, červená zrna obvykle do 10%. U rodičovských druhů byl podíl zrn fialových kolem 70%, červených kolem 10%. Protože rostliny křížence F2 a 7/31 v roce 2003 uschly, pozdější analýzy být provedeny nemohly. Vitalitu pylu těchto rostlin dokládají i dozrálé šáchy z roku 2002.

Teprve v roce 2004 se vyčlenila čtvrtá kategorie pylových zrn - zrna růžová (ve čtyřkategoriálním členění s označením III), která byla vybarvená v celém obsahu zrna, ale ne nijak intenzivně, takže šlo o zrna se zbytkovou enzymatickou aktivitou, která mohla být u čerstvějšího pylu hodnocena prvním a druhým stupněm. Vzorky byly dělány na jedno podložní sklíčko třikrát, vždy z nejméně dvou tyčinek jednoho květu na vzorek.
Poznámky k hodnotám v následujících tabulkách (14.3.2a,b,c):
'*' označuje, že dílčí výsledky u jednoho preparátu se lišily o víc než 10%

Každý řádek představuje jeden preparát (dva vzorky na jednom podložním skle; každý vzorek byl vytvořený z alespoň dvou tyčinek)

Tabulka 14.3.2a - srovnání vitality pylu mezi taxony:

		pylová zrna
vzorek	fáze	I [%]	II [%]	III [%]	IV [%]	 [ks]
T	sv	66,2	2,9	6,5	24,4	275
	p	79,7	4,7	2,4	13,2	380
H	sv	42,2	11,1	6,5	40,3	325
	sv	63,2	8,7	3,0	25,1	299
O	j	71,3*	16,8*	8,2	3,7	268
	p	71,1	3,2	13,4*	12,2*	433

Fáze ontogeneze květů: p-panenská, sv-svíčka, sa-samčí, j-ježek

Vitalita pylu se mezi druhy příliš neliší, údaje z jiných měření u M. tripetala u tohoto druhu dávaly nezřídka obraz i o vitalitě nižší než u křížence. Nebyl splněn požadavek na srovnání vitality pylu u květů ve stejné fázi, leč pylová vitalita podstatně klesá až u pylu delší dobu otevřených prašníků, proto data určitou výpovědní hodnotu mají, viz dále. Podíl pylových zrn s nevitálním obsahem (IV kategorie) byl u křížence oproti rodičovským druhům poměrně vysoký.

Tabulka 14.3.2b - srovnání vitality pylu u M. obovata podle fází ontogeneze květů:

vzorek	pylová zrna
	I [%]	II [%]	III [%]	IV [%]	 [ks]
panenská	71,1	3,2	13,4*	12,2*	433
	85,7	7,5	3,6	3,1	413
samec ježek	36,8	13,5	23,5	26,2	340
	71,3*	16,8*	8,2	3,7	268
samec starý	24,4	11,6	49,3*	14,7*	225

V tabulce 14.3.2b je naznačen trend klesající vitality pylu se stářím pylu. Vitalita pylových zrn se mění s časem III-III; IIIII. Pyl starších květů má poměrně významný podíl pylových zrn III kategorie, tzn. že původně vitální pylová zrna mají zbytkovou enzymatickou aktivitu v téměř celém svém objemu a lze je odlišit od zrn původně vůbec nevitálních (IV).

Tabulka 14.3.2c - srovnání variability vitality pylu u stejných fází stejných taxonů:

vzorek	pylová zrna
	I [%]	II [%]	III [%]	IV [%]	 [ks]
H svíčka	63,2	8,7	3,0	25,1	299
	42,2	11,1	6,5	40,3	325
O ježek	71,3*	16,8*	8,2	3,7	268
	56,9*	17,0*	22,5*	3,6	276

Tabulka 14.3.2c ukazuje, že i mezi vzorky téže fáze ontogeneze květů u téhož taxonu jsou rozdíly značné (řádově desítky procent). Malý rozdíl zjištěné vitality pylu je mezi samčí fází 'ježek' a přechodovou fází 'svíčka'. To lze vysvětlit jen případnou krátkou dobou vystavení pylu vzduchu (minuty až hodiny v případě u 'ježka', u 'svíčky' vůbec) a jen krátkou časovou vzdáleností zmíněných fází v ontogenezi květů.

14.3.3 Diskuse
Rozdíly spočítaných hodnot vitality pylu jsou mezi vzorky týchž preparátů značné (přes 10%) - viz tabulky s výslednými hodnotami (kapitola 14.3.2). To lze interpretovat buď nepřesností hodnocení pylových zrn při vlastním počítání vitality pylu, malým počtem počítaných pylových zrn/preparát, nebo existující skutečnou variabilitou různě vybarveného pylu v různých sektorech vzorků a mezi vzorky. Počet počítaných pylových zrn/vzorek bylo řádově několik set, takže statistická chyba za předpokladu homogenně vybarvených vzorků by měla být řádově v několika procentech (5%) a přílišná heterogennost vzorků za předpokladu jejich kvalitní přípravy by měla být vyloučena. Klasifikace vybarvení pylových zrn byla celkem jednoznačná, přesto nezabránila patrným potížím při vyhodnocování vzorků.

Přes výše uvedené potíže s nepřesností analýz byla prokázána vitalita pylu u kříženců F2 generace a rostliny 7/31.

Je třeba zdůraznit, že testování enzymatické aktivity pylu nic nemusí vypovídat o skutečné fertilitě pylu (schopnosti opylování).

Sníženou vitalitou pylu v daném případě nelze prokazovat hybridní původ rostlin (vitalita srovnatelná s rodičovskými druhy).

14.4 Testování vitality pylu ručním opylováním květů
Při vlastních umělých hybridizacích bylo zaznamenáváno stáří pylu použitého k opylování. Ještě u pylu (tyčinek) skladovaného v igelitovém (ne zcela uzavřeném, v temnu) pytlíku 3 dny byl zaznamenán případ zrajícího šáchu. Výsledky křížení dokumentuje tabulka 14.4.

Tabulka 14.4:

stáří pylu	1 den	2 dny	3 dny
výsledky	12 x ++; 2 x -	5 x ++; 1 x +; 1 x -	1 x ++; 1 x -; 2 x --; 1 x ?

Vysvětlivky kategorií uvedených v tabulce 14.4:

++... prokazatelně dozrávající souplodí sklizená v době zralosti

+... souplodí, jež se po opylení začaly zdárně vyvíjet, ale v době zralosti nebyly k dispozici (opylovaná rostlina mohla uschnout, souplodí se v době sklizně zralých souplodí se již nenašlo - bylo odcizeno)

-...souplodí nezačalo dozrávat, ale před sklizní se nedochovalo

--... souplodí bylo po odkvětu jednoznačně redukováno

?... po odkvětu o souplodí žádný záznam

Pozitivní výsledky hybridizací u 1-2 dny starého pylu jsou celkem jednoznačné, u pylu starého 3 dny by patrně bylo možno zaznamenat více pozitivních výsledků v případě četnějších (nikoli jen 5) a obvyklých křížení (ve 4 případech bylo provedeno křížení s pylem Magnolia sieboldii, opylována byla 3x poupata usychajícího křížence, v 1 případě dokonce s nenaježenými bliznami). Pyl starší prokazatelně déle než 4 dny k hybridizacím použit nebyl. V roce 2002 byl u 4 květů použit pyl staršího květu, pouze v jednom případě ale bylo pozorováno dozrávání šáchů. Testování vitality pylu ručním opylováním není příliš přesné, neboť nanesení nadbytku pylu na blizny může případnou sníženou vitalitu pylu kompenzovat (vzácná, ale ve velkém množství pylu přítomná vitální zrna mohou blizny opylit).

K opylování květů byl nezřídka používán i pyl květů nesáčkovaných. Tato skutečnost byla zaznamenávána, ale kromě možnosti získání přimíšených semen v souplodích z jiného než cíleného křížení tento fakt nebyl významný (kontaminujících pylových zrn byl v používaném pylu k opylení malý počet). Pylová inkompatibilní reakce (při geitonogamickém opylení) se nikdy neprojevila ani u sáčkovaných květů (smíšený pyl nesáčkovaných květů by mohl hypoteticky vyvolat tzv. 'mentor efekt', který by projevu inkompatibility mohl zabránit).

Tabulka 15.1 shrnuje množství dozrávajících šáchů. K tomu, aby se vitalita (fertilita) pylu projevila, stačí dozrávání poměrně malého počtu semen v souplodích, aby souplodí skutečně dozrála. Kvalitu (fertilitu) pylu metodou ručního opylování lze mnohem lépe vyhodnotit pomocí podílu dozrávajících semen v souplodích (kolik vajíček bylo skutečně opyleno), viz kapitola obsah semen v souplodích.

14.5 Množství tvořeného pylu
Množstvím tvořeného pylu u Magnolia grandiflora se zabýval Allain (1999). Zjišťoval množství tvořeného pylu v jednotlivých tyčinkách pomocí cytometru (hemacytometru) a výsledky přepočítal i na celé květy. Osobně jsem množství tvořeného pylu nezkoumal žádnými instrumentálními metodami, ale při umělých hybridizacích jsem si mnohdy povšiml menšího množství pylu dostupného z tyčinek křížence ačkoli prašníky byly čerstvě otevřené (někdy dokonce nebylo možné provádět hybridizace). V množství tvořeného pylu byla mezi květy možná i variabilita, bohužel se ale jedná jen o subjektivní posouzení.

15 Analýza plodnosti rostlin
Samotná analýza vitality pylu využívající chemického barvení (průkaznost enzymatické aktivity) nevypovídá nic o skutečné fertilitě pylu (schopnosti opylení rostlin a oplození samičích gamet). Teprve tvorba dozrávajících souplodí s dobře vyvinutými semeny (vyvíjejících se ať již po umělém či přirozeném opylení) vypovídá o skutečné fertilitě tvořených gamet (a o plodnosti rostlin). Klíčivosti semen je věnována zvláštní kapitola.

Při řešení otázek plodnosti rostlin je možno k problému přistupovat dvěma způsoby:

1) zaznamenávat plodnost celých rostlin (počítat dozrávající souplodí na jednotlivých rostlinách)

2) u vybraných souplodí spočítat obsah vyvíjejících se semen (zde je pak možno hledat rozdíly i mezi taxony, neboť morfologické analýzy prokázaly rozdíly v množství měchýřků v souplodích)

Důležitým faktorem je, že souplodí s malým obsahem vyvíjejících se semen jsou redukována - opadávají nedozrálá krátce po odkvětu

15.1 Plodnost jednotlivých rostlin
Plodnost byla zaznamenávána u rostlin, které během vegetační sezóny kvetly (musel jsem nalézt alespoň nepřímé důkazy o kvetení - bezsemenné šáchy na zemi). Všechny kvetoucí rostliny později také plodí kromě rostlin v Cluji a některých rostlin křížence rostoucích v Průhonickém parku. Rozdíly v množství dozrávajících souplodí odrážejí spíše rozdíly v množství květů na stromech (větší stromy mají více květů). Plodnost dokazuje dobré opylování (opylování pomocí místních brouků).

taxon	Lokalizace	Poznámka
T	Bezděkov - zahrada p. Plného, č.p. 41	v roce 2004 asi 90 šáchů, v r. 2005 rovněž plodící
T	Bílá Lhota u Litovle - arboretum 2x	obě rostliny v roce 2001 bohatě plodily
T	Hluboká n. Vltavou - zámecký park	7 šáchů na stromě v r. 2004
T	Hronov - Žabokrky - zahrada p. Macury, č.p. 26	v r. 2004 asi 80 šáchů, mezi r. 2001-2005 každoročně plodící
T	Konopiště - Růžová zahrada 2x	obě rostliny v letech 2004 a 2001 bohatě plodily
T	Kopidlno - zámecký park	v roce 2004 bohatě plodící
T	Kórnik (Polsko) - arboretum 2x	v r. 2002 obě rostliny plodily
T	Kostelec nad Černými Lesy - arboretum	v r. 2003-2004 plodící
T	Nový Dvůr u Opavy - arboretum 2x	v r. 2002 rostlina 'a' bohatě plodící, 'b' neplodící
T	Písek - arboretum VOŠL a SLŠ	v r. 2002 plodící
T	Plzeň - Křižíkovy sady 5x	v r. 2004 plodící
T	Plzeň - Šafaříkovy sady (před ZČ muzeem)	v r. 2001 plodící
T	Praha - Botanická zahrada PřF UK	od r. 2001 každoročně plodí
T	Průhonice - areál VÚKOZ	v letech 2002-2004 bohatě plodící
taxon	Lokalizace	Poznámka
T	Praha - zastávka 'Sídliště Malešice', před marketem Delvita 10x	v letech 2001-2004 bohatě plodící (počty souplodí v r. 2004 na 'multimedium-pruhoniciana-fenologie')
T	Ráby - před Perníkovou chaloupkou	v r. 2004 plodící
O	Bonn (Německo) - botanická zahrada, podle fotogalerie K. Stübera*	plodící
O	Cluj-Napoca (Rumunsko) - univerzitní botanická zahrada 2x	2 rostliny, u jedné prokázáno kvetení (sebrány šáchy), obě rostliny neplodné v r. 2003 (M. kobus v zahradě plodila)
O	Kostelec n. Černými Lesy 3x	v r. 2003-2004 všechny rostliny plodící, vzhledem k počtu květů nízká plodnost
O	Praha - Botanická zahrada PřF UK	v r. 2001-2004 plodící
O	Průhonice - zámecká obora	od r. 2001 plodící
O	Velké Březno - zámecký park	v r. 2003 plodící
H	Lednice na Moravě - jedinec u Benátské kašny	plodí (poměrně) pravidelně (Doc. Pejchal, os. sdělení)
H	Průhonice - zámecký park a obora	v r. 2001-2004 rostliny obvykle plodící, existují však skupiny rostlin, pod kterými nebylo možno nalézt žádná souplodí
H2	Praha - ZOO	skupina zaplavená v r. 2002 plodící
H2	Herkenrode (Belgie) - arboretum	podle P. Spoelbercha (e-mail 2005) dobře plodící
H?	Průhonice - Chotobuz, č.p. 170	v roce 2001 patrně neplodila, v r. 2002 jen asi jedno souplodí, v r. 2003-4 ne více než 3 šáchy

Tabulka 15.1:

* Dr. Kurt Stüber z Max Planck Institut für Züchtungsforschung, fotogalerie URL: http://caliban.mpiz-koeln.mpg.de/%7Estueber/mavica/
T... M. tripetala

O... M. obovata

H... kříženec H2... kříženec F2 generace