Diplomová práce

Thien (1974) nalezl v 60 květech 25 rostlin M. tripetala v Severní Americe 5 ks Epuraea ovata, 3 ks Macrodactylos angustatus a 1 ks Derelomus bicolor. U dalších severoamerických druhů magnólií byl v květech nalézán velmi často typicky americký rod Conotelus sp. a velmi často pak zejména Staphylinus sp.

Yasukawa et al. (1992) u M. obovata rostoucí v Japonsku popisuje nálezy brouků Nitidulidae sp., Oedemeronia lucidicollis, Oxycetonia jucunda, případně Athemus suturellus, ale i další druhy hmyzu dvoukřídlého a blanokřídlého.

Z výsledků četných studií vyplývá, že jako efektivní opylovači rodu Magnolia se uplatňují zejména drobné druhy brouků. Má vlastní práce tento závěr potvrzuje. Z hlediska ekologického jsou opylovači nespecializovaní, kteří jsou hojně nalézáni v květech rostlin jako pěstovaná řepka olejka (Brassica napus), či bíle a žlutě kvetoucích lučních rostlin (např. rodu Taraxacum).

13 Hybridizace Magnolia obovata x M. tripetala
13.1 Úvod
Dvě populace pocházející ze společného předka a obývající dvě geograficky rozdílná území (tj. allopatrické) se v průběhu času postupně a navzájem mění. Výsledkem mohou být populace potomků, které se od sebe liší v morfologických znacích, a jsou navzájem reprodukčně izolovány. Existence izolačních mechanizmů vyjde najevo v případě opětného umožnění hybridizace rostlin z oddělených populací (Briggs et Walters 2001). Toto schéma není nepodobné situaci blízce příbuzné americké Magnolia tripetala a japonské M. obovata, jejichž populace se velmi pravděpodobně vyvinuly v důsledku rozdělení areálu jejich společného předka před 27,9 ± 4,4 milióny let (Azuma et al. 2001) a jejichž hybridizaci bylo možno studovat v Průhonickém parku v České republice.

Odlišnostem M. tripetala a M. obovata a konkrétním projevům jejich hybridizace je věnována naprostá většina kapitol této práce, tato kapitola je zaměřena na vlastní hybridizační experimenty. Literární dostupné údaje o hybridizacích jednotlivých taxonů magnólií jsou shrnuty v 'multimedium-Magnolia-hybridizace'. Na tomto místě je třeba zmínit, že v přírodě je hybridizace magnólií poměrně vzácná, naproti tomu ve šlechtitelství je nástrojem k získávání obrovského množství kultivarů a mnohonásobných kříženců. Ne všechny hybridní kombinace v rámci rodu (event. mezi tradičně rozlišovanými rody v čeledi Magnoliaceae) jsou možné a genetická vzdálenost jednotlivých druhů (dnes již dobře známa díky četným kladistickým studiím, např. Kim et al. 2001, Azuma et al. 2001, Azuma et al. 1999) se odráží na vitalitě jejich kříženců. Hybridizace samotná je také jedním z nástrojů, jak genetickou vzdálenost testovat (a posléze klasifikovat taxony). Ačkoli nám hybridizační experimenty poskytují cenné informace, interpretovat je lze jen velmi opatrně. V této konkrétní studii se pracovalo s omezeným počtem jedinců (zejména rodičovských druhů, skupiny kříženců naproti tomu pocházejí z křížení patrně jen dvou konkrétních rostlin) a hybridizační experimenty končily omezeným křížením jedinců F2 generace (několika rostlin v pražské ZOO, jejichž semenáčky - teprve F3 generace kříženců, by dosáhly schopnosti generativní reprodukce teprve za několik let). Naproti tomu částečně umělé podmínky při opylování (izolační obaly na květy, skladování pylu v pytlících apod.) obvykle nevedly k nečekaným výsledkům pokusů. Stanovení fertility pylu nebylo odkázáno jen na metodu jeho barvení, tedy nepřímých důkazů, ale i přímým opylováním (které bohužel nemá takovou citlivost na rozlišení kvality pylu, zejména je-li opylování prováděno nanášením nadbytku pylu na blizny). Prezygotickým i postzygotickým izolačním faktorům byla také věnována zvláštní pozornost (viz dále).

13.2 Přírodní hybridizace
Hybridizace Magnolia obovata a M. tripetala v přírodě vzhledem k interkontinentálnímu rozšíření těchto druhů není možná. Přirozené křížení připadá v úvahu jen v introdukčních podmínkách alespoň jednoho rodičovského druhu. K této hybridizaci došlo pravděpodobně v Arnoldově arboretu, odkud jsou popsáni přirozeně vzniklí kříženci, Spongberg et Weaver (1981). Hybridní semena mohou vznikat také u blízkorostoucích rostlin rodičovských druhů pěstovaných plně v introdukčních podmínkách - v Evropě apod. Zde je třeba počítat s omezenou mobilitou opylovačů, kteří sice patrně botanické druhy nedokáží rozlišit (viz kapitola o opylovačích), ale mají omezenou mobilitu (čím vzdálenější jsou rostliny, tím méně pravděpodobná je jejich hybridizace). Na základě vlastních experimentů byly vyloučeny endogenní zábrany jakéhokoli opylení pěstovaných rostlin M. obovata, M. tripetala a jejich křížence. Vznik semen v souplodích, vzniklých z květů neopylovaných uměle, dokazuje přírodní opylení (semena nikdy nevznikají agamospermicky a v žádném případě nemohou vzniknout samoopylením jednoho květu - tomu brání časové oddělení zrání gamet a prostorové oddělení pohlavních orgánů). Přírodní opylení květů nikdy nedosahuje takové kvality, jako správně provedené opylení umělé (viz kapitola obsah semen v souplodích).


13.3 Umělá hybridizace
K provedení umělé hybridizace je třeba znát ontogenezi květů (viz kapitola ontogeneze květů) a dodržovat několik zásad. V roce 2002 byla ontogeneze květů popsána nejen morfologicky, ale i z hlediska receptivity blizen a fertility pylu, podmínky při vlastních hybridizacích byly pečlivě zaznamenávány (hybridizační protokoly jsou na 'multimedium-data-hybridizace'). Fertilitě pylu jsou věnovány zvláštní podkapitoly analýzy pylu.

Umělé opylení by mělo být provedeno s využitím čerstvého pylu z květu opatřeného vzdušným látkovým sáčkem (monofil, jemná záclonovina) bránícím kontaminaci pylu cizím pylem (zanešeného opylovači). Opylovaný květ by měl být opatřen stejným sáčkem (zabránění nechtěného opylení opylovači) a měly by být pečlivě opyleny všechny blizny (nanášením pylu povrchem pinzety, kterou dáváme do pytlíku s vyprašujícími se tyčinkami) v panenské fázi (otevřený květ s naježenými papilózními bliznami - obvykle odpolední až večerní hodiny). Při provedení hybridizace musíme příslušný květ označit pomocí cedulky či nálepky (pro jeho pozdější identifikaci) a zaznamenat údaje o stáří a původu pylu, případně i čas provedení vlastního opylení. Sáček je z květů možno odstranit již ve fázi svíčky, zpravidla byl však odstraňován až ve fázi alespoň ježka s možností získání nekontaminovaného pylu pylem jiného květu. Jakékoli odchylky od tohoto postupu musí být vždy zaznamenány.

Opylovacích experimentů (opylování všech pestíků jednoho květu pylem z jiného přesně daného květu) bylo v roce 2002 provedeno 36, v roce 2003 bylo provedeno 94 a v roce 2004 pak 13 opylovacích experimentů (celkem 143 opylovacích experimentů). Cílem bylo zejména ověření křížitelnosti Magnolia obovata, M. tripetala, jejich křížence a případně i M. sieboldii (viz schéma).

Schéma 13.3 - Rodičovské (P-parentální) druhy jsou vzájemně kříženy, takže dávají vzniknout první filiální generaci kříženců (F1). Tito kříženci jsou zpětně kříženi s rodičovskými druhy (vznik B1 generace, z anglického 'back-cross'), ale i mezi sebou (vzniká druhá filiální generace F2). Kromě křížení různých rostlin bylo testováno i geitonogamické opylování testující pylovou inkompatibilitu (opylování pylem téže rostliny - označeno žlutohnědým 'i'). TT, HH... označuje taxonomickou konstituci genotypů (TT-100% M. tripetala, HH-100% kříženec-tedy 50% M. tripetala a 50% M. obovata, TH-50% M. tripetala, 50% kříženec, celkově tedy 75% M. tripetala a 25% M. obovata - u kříženců jsou procentuální hodnoty taxonomické konstituce jen přibližné, viz poznámka níže*). Do křížení byla zapojena i M. sieboldii, jejíž kříženci s M. tripetala a M. obovata jsou známi (v případě křížení s kříženci F1 tak dochází ke vzniku trojnásobného křížence).

*Poznámka: Do gamet křížence F1 generace se obvykle nedědí vlohy původních rodičů přesně stejným dílem, proto kontstituce genotypů je jen přibližná.
Tabulka 13.3 - Počty dozrávajících šáchů po provedených umělých hybridizacích v letech 2002-2004 (různé typy a směry křížení):

♀ x ♂	++	+	-	--	?		+/ [%]
H2 x O		1	2	1		4	25,0
H x H	12	2	3	2	2	21	66,7
H x H i	4		1		3	8	50,0
H x H2				1		1	0,0
H x O	20	2	6	2		29	75,9
H x S				4	2	7	0,0
H x T	9	5			2	16	87,5
O x H	2		1		1	4	50,0
O x O	2					2	100,0
O x O i	4			1		5	80,0
O x S		2				2	100,0
O x T	2		2	2	1	7	28,6
S x H			2			2	0,0
S x O			3			3	0,0
T x H	2	1		1		4	75,0
T x O	6	2			2	10	80,0

Vysvětlivky kategorií uvedených v tabulce 13.3:

++... prokazatelně dozrávající souplodí sklizená v době zralosti

+... souplodí, jež se po opylení začaly zdárně vyvíjet, ale v době zralosti nebyly k dispozici (opylovaná rostlina mohla uschnout, souplodí se v době sklizně zralých souplodí se již nenašlo - bylo odcizeno)

-...souplodí nezačalo dozrávat, ale před sklizní se nedochovalo

--... souplodí bylo po odkvětu jednoznačně redukováno

?... po odkvětu o souplodí žádný záznam

... součet počtu analyzovaných souplodí

+/... počet souplodí s výsledkem ++ nebo + dělený celkovým počtem všech souplodí

Všechny možné teoretické plánované kombinace, podtrženy realizované:

TO, OT, TH, HT, OH, HO, HH, OO i, TT i, HH i, OO, TT, HH, H2O, H2T, H2H, TH2, OH2, HH2, SO, OS, ST, TS, SH, HS
Z provedených hybridizačních pokusů vyplývá, že většina pokusů měla úspěšnost křížení spolehlivě vyšší než 50%. Ve skutečnosti k tomuto číslu nemohla být přičtena byť pozitivní, ale ne prokazatelná další jinak dozrávající souplodí, která byla během dozrávání zcizena. Neúspěšné hybridizace s M. sieboldii lze vysvětlovat spíše stářím pylu a sesychajícím opylovaným stromem. Neúspěšné umělé křížení s F2 kříženci je opět vysvětlitelné usycháním plodících rostlin a příliš časným opylováním poupat. Prezygotické inkompatibilní reakce (při geitonogamickém opylení) se neprokázaly ani u křížence, ani u M. obovata, McDaniel 1963 sec. Thien 1974 je vylučuje u M. tripetala a přirozeně plodící izolované rostliny pěstované v ČR je také vylučují. Mezi zúčastněnými taxony lze předpokládat volnou křížitelnost, nezávislou na směru křížení (který taxon je opylovaný a který zdrojem pylu). Možnost tvorby semen agamospermicky, samoopylení (opylení blizen pylem vlastního květu) a nežádoucího opylení květů v sáčcích (pronikání opylovačů přes sáčky nebo opylení pylem, který se na sáčcích mohl zachytit z jiného květu) vylučuje několik květů, které nebyly uměle opylovány a byly do odkvětu jen uzavřeny v sáčcích (ne vždy byly tyto případy zahrnuty do záznamů; prokazatelné ve zhruba desítce případů). Křížitelnost je také vyhodnotitelná z hlediska obsahu semen v souplodích (viz kapitola 'obsah semen v souplodích'), nejen poměry ne/dozrávajících souplodí.

Při příležitosti prováděných hybridizací byla dále testována použitelnost různého pylu k opylování (viz kapitola 'analýza pylu') a použitelnost různě starých poupat a květů k opylování (což se projevilo právě i v podílu neúspěšných hybridizací, kdy byla sledována především křížitelnost mezi taxony). Úspěšnost opylování poupat s naježenými a nenaježenými bliznami shrnuje následující tabulka 13.3a.

Tabulka 13.3a:

	++	+	-	--	?		+/ [%]
naježené blizny	32	6	6	4	7	55	69,1
nenaježené blizny	1		2	6	1	10	10,0

Opylování poupat s naježenými bliznami je velmi úspěšné (asi 70%, opět údaj zkreslují okolnosti u jednotlivých opylování), zatímco opylování poupat s dosud nenaježenými spíše neúspěšné (tady prověřením konkrétních záznamů nešlo o zkreslení dané stářím pylu nebo nekvalitním opylováním). Přesto i v tomto případě jistou naději umožňuje nanesení velkého množství pylu na dosud nereceptivní blizny, který do doby začátku receptivnosti blizen neztratí svoji fertilitu. Opylování blizen již nereceptivních (ve fázi svíčky a v samčí fázi) nemá žádný smysl (potvrzuje 5 zcela neúspěšných křížení).

13.4 Prezygotické a postzygotické izolační faktory
Prezygotické izolační faktory v případě studovaných magnólií nepřipadají v úvahu. Opylovači patrně nedokáží rozlišit květy M. obovata od M. tripetala, ani od jejich křížence. Otázka, zda opylovači z místa výskytu přirozených populací rodičovských druhů něčeho takového schopní jsou, nebyla experimentálně prověřována. Studie opylovačů těchto přirozených populací však naznačují, že tito opylovači nepatří mezi opylovače specifické (rody brouků Meligethes, Epuraea, Dasytes, zástupci čeledi drabčíkovitých aj., viz kapitola efektivní opylovači). Za předpokladu, že hlavním atraktantem květů magnólií je vůně, jejíž chemické složení je pro jednotlivé druhy magnólií specifické, nelze závěr druhové specifity opylovačů jednoznačně vyloučit. Existují však ale i další rozdíly mezi květy magnólií (barva, velikost, postavení květních orgánů), které určitou specifitu opylovačů ovlivňovat mohou také (to však s největší pravděpodobností není případ Magnolia sect. Rytidospermum ser. Rytidospermae, kde květy vypadají velmi podobně). U křížence Magnolia obovata x M. tripetala nedávám sníženou plodnost rostlin (v Průhonickém parku pod některými rostlinami nebylo možné nalézt souplodí se semeny) do souvislosti s hybridně utvářenými květními orgány (hybridní forma vývoje květů u Magnolia obovata x M. tripetala neslučuje naprosto odlišné způsoby vývoje květů rodičovských druhů) či fertilitou pylu (pyl je fertilní), nýbrž především lokalizací rostlin (izolované rostliny v hustých, pro opylovače zřejmě nepříliš atraktivních porostech).

Tvorbě hybridních semen mohou částečně bránit rozdíly ve fenologii rodičovských druhů (M. tripetala kvete dříve než M. obovata, ale na konci jejího období květu začínají rostliny M. obovata již také kvést - více viz kapitola fenologie).

Postzygotické izolační faktory (PzIF) bohužel nemohly být studovány dále než do F3 generace kříženců. Rostliny F1 generace vzniklé z hybridních semen jsou plně vitální, stejně tak klíčivost hybridních semen a vitalita pylu hybridního potomstva nenaznačují existenci PzIF mezi taxony (viz kapitoly klíčivost semen a analýza pylu). Naproti tomu subjektivně posouzené množství pylu již ve srovnání s rodičovskými druhy jistou diferenci naznačuje (u kříženců se tvoří patrně méně pylu).

Ani semena F1 kříženců (tedy již F2 generace) nevykazují sníženou klíčivost. Vitalitu rostlin F2 generace je již těžší vyhodnot (menší počet rostlin, nevhodné podmínky pro růst něktých rostlin apod.). Rostliny rostoucí v pražské ZOO vykazovaly v případě skupiny blížeji Vltavě (zaplavené v r. 2002) normální růst, stejně jako rostliny rostoucí v Herkenrode (viz foto č. 116 v Hunt 1998). Rostliny druhé skupiny rostoucí v pražské ZOO (nezaplavené, ale seschlé v roce 2003) byly patrně vysazeny na nevhodné místo (nevýživný a suchý substrát), proto vykazovaly omezený vzrůst i velikost svých orgánů. Umělé opylení u těchto rostlin úspěšné nebylo, což se dalo předpokládat již z podmínek této hybridizace - opylována byla příliš mladá poupata. Naproti tomu tvorbu přirozeně vzniklých semen (F3 generace kříženců) bylo možno zaznamenat u rostlin první skupiny rostoucí v pražské ZOO (zaplavené v roce 2002) i u rostliny H7/31 s odlišnou morfologií, isoenzymovým pattern a vzrůstem odpovídajícím již F2 generaci.

Konkrétní důkazy plodnosti jednotlivých rostlin až po F2 generaci kříženců a klíčivost hybridních semen tedy vylučují existenci PzIF a potvrzují spolu s vitálním růstem rostlin a fertilním pylem hybridních rostlin (v těchto parametrech srovnatelných s rodičovskými druhy) genetickou blízkost rodičovských druhů.



14 Analýza pylu
14.1 Úvod
Cílem analýz bylo zjištění vlastností pylu zejména z hlediska jeho vitality (fertility, životaschopnosti, kvality). V zásadě byly uplatněny dvě metody jeho studia 1) test enzymatické aktivity 2) metoda ručního opylování květů. Právě pylová analýza může odhalit hybridní původ rostlin u nichž tvorba nevitálního pylu dokazuje genetickou vzdálenost nebo nekompatibilnost rodičů (příčinou snížené vitality gamet bývá nepravidelný průběh meiózy při gametogenezi, produkující geneticky nevyvážené gamety), Krahulcová (1998). Tvorba nevitálního pylu u kříženců v přírodě (vedoucí až k jejich sterilitě) je jedním z reprodukčně isolačních (postzygotických) mechanizmů, které brání úspěšnému křížení sympatricky rozšířených populací dvou druhů.

Analyzovány byly rozdíly kvality pylu 1) na mezidruhové úrovni (zejména srovnání křížence a rodičovských druhů) 2) rozdíly ve fázích ontogeneze květů 3) rozdíly ve variabilitě mezi rostlinami jednotlivých taxonů

14.2 Morfologie pylových zrn
Pylová zrna rodu Magnolia mají dlouhý kolpus, jsou bilaterální, heteropolární, s jednoduchou aperturou.

14.3 Testování enzymatické aktivity
Tato metoda patří mezi nepřímé metody testování vitality pylu (přímé metody jsou založeny na sledování klíčení pylu ve vhodném prostředí - in vitro či in vivo). Enzymatické testy jsou založeny na přítomnosti oxidačně-redukčních reakcí, které souvisejí s buněčnou respirací. Používaná barviva jsou původně bezbarvá a na barevnou formu se mění během oxidačních či redukčních změn. Tyto změny probíhají v přítomnosti aktivních buněčných enzymů. Předpokládá se tedy, že obarvená pylová zrna jsou životaschopná.