Probiotika, prebiotika a synbiotika

4.2.Escherichia coli Nissle 1917 a 83972

Do druhu gramnegativní Escherichia coli patří jak patogeny schopné působit infekce v gastrointestinálním i močopohlavním traktu tak i řada komenzálních kmenů. Z nich dva, E. coli Nissle 1917 a E. coli 83972, jsou probiotiky s klinicky ověřenými účinky u člověka. E. coli Nissle 1917 byla izolována ze střeva, jež kolonizuje, a E. coli 83972 z močových cest, kde se dlouhodobě vyskytuje. Oba tyto kmeny jsou nejblíže příbuzné uropatogennímu (UPEC) kmenu E. coli CFT073, s nímž sdíleli společného patogenního předka (Hancock a kol. 2010b). U E. coli Nissle 1917 i 83972 byla pozorována schopnost dobře tvořit biofilm na biotických i abiotických substrátech (Hancock a kol. 2007, Lasaro a kol. 2009, Hancock a kol. 2010a,b).

4.2.1.Adheziny u Escherichia coli

Adheze E. coli se jako adheziny účastní curli, fimbrie typu 1 a také antigen 43, který zprostředkovává vazbu mezi bakteriálními buňkami (Goller a Romeo 2008). Na příklad u UPEC kmenů E. coli ale byla navíc popsána i tvorba P (Kärkkäinen a kol. 1998), S (Castelain a kol. 2010) a F1C fimbrií (Pere a kol. 1985). Kmen E. coli Nissle 1917 netvoří P ani S pili (Grozdanov a kol. 2004), fimbrie typu 1 a F1C fimbrie však produkuje (Lasaro a kol. 2009). U E. coli 83972 se nevyskytují fimbrie typu 1, P fimbrie (Klemm a kol. 2006) ani F1C fimbrie (Ross a kol. 2006).

4.2.1.1.Curli

Curli jsou extracelulární bílkovinná vlákna, která u E. coli zprostředkovávají adhezi na biotické i abiotické substráty a také vznik biofilmu. Podněcují prvotní adhezi na povrch i vazbu mezi buňkami samotnými (Prigent-Combaret a kol. 2000). Ve vnějším prostředí je tvorba curli aktivována při nízké teplotě, mikroaerofilních podmínkách, malém množství dusíku, fosfátu a železa, nízké osmolaritě a pomalém růstu nebo nedostatku živin (Olsén a kol. 1993). V biofilmu však může jejich tvorba probíhat i při 37ºC (Kikuchi a kol. 2005). Produkci curli spolu s celulózou, které dohromady tvoří matrix biofilmu E. coli, spouští c-di-GMP (Weber a kol. 2006).

4.2.1.2.Fimbrie typu 1

Fimbrie typu 1 jsou manosa-specifické a jsou rozšířené v celé čeledi Enterobacteriaceae. Jsou důležité pro kolonizaci hostitelských tkání a tvorbu biofilmu na abiotických površích (Pratt a Kolter 1998). Jejich produkce závisí na živinách a je inhibována nízkým pH, nízkou teplotou a vysokou osmolaritou (Goller a Romeo 2008).

4.2.1.3.Antigen 43

Antigen 43 (Ag43) patří do tzv. SAAT (self-associating autotransporter) skupiny proteinů, která zahrnuje ještě vnější membránový glykoprotein TibA a AidA (adhesin involved in diffuse adherence) protein. Tyto proteiny spolu mohou interagovat a umožnit vznik bakteriálních shluků (Klemm a kol. 2006). Na agregaci má vliv hodnota pH ve vnějším prostředí. Při nižším pH dochází k rychlejší agregaci. Exprese Ag43 u E. coli podporuje vznik biofilmu a antigen je produkován i během jeho růstu (Klemm a kol. 2004).

4.2.1.4.F1C fimbrie

F1C fimbrie jsou podstatné pro adhezi na biotické a abiotické substráty i pro tvorbu biofilmu (Lasaro a kol. 2009). Lasaro a kol. (2009) pozorovali, že F1C fimbrie hrají hlavní roli při adhezi E. coli Nissle 1917 na skleněný povrch. Účastnily se také vazby na buňky HEp-2, epiteliální buňky lidského původu, při které byla pravděpodobně stejně důležitá i přítomnost fimbrií typu 1. Při kolonizaci střeva myších mláďat měly F1C fimbrie vliv na následnou perzistenci bakterií ve střevě (Lasaro a kol. 2009). V pozdějším vývojovém stádiu biofilmu tvořeném v moči se však neuplatňovaly (Hancock a kol. 2010b).

4.2.2.Tvorba biofilmu u Escherichia coli Nissle 1917 a 83972

Oba probiotické kmeny E. coli Nissle 1917 i 83972 tvoří biofilm dobře na polystyrenovém i skleněném povrchu. A to jak při statické inkubaci tak i v proudící tekutině (médiu) (Hancock a kol. 2007, Lasaro a kol. 2009, Hancock a kol. 2010a). Při kultivaci v minimálním ABTG médiu rostl biofilm lépe u kmene Nissle 1917 než kmene 83972, zatímco v LB médiu, MOPS médiu a také lidské moči tomu bylo naopak (Hancock a kol. 2010a).

Schopnost tvořit biofilm se často počítá mezi virulentní faktory, zde zmiňované probiotické kmeny však tvoří v různých kultivačních médiích i moči jednodruhový biofilm lépe a rychleji než ostatní a především patogenní kmeny E. coli (Hancock a kol. 2007, Hancock a kol. 2010a,b). Při kompetici s komenzálními i patogenními kmeny E. coli v ABTG médiu byla E. coli Nissle 1917 jednoznačně nejúspěšnější a tvořila většinu biomasy v konečné populaci smíšeného biofilmu (Hancock a kol. 2010a). Naopak v moči, MOPS a LB médiu však byl úspěšnějším kompetitorem uropatogenní kmen CFT073 (Hancock a kol. 2010b). E. coli Nissle 1917 produkuje kolicin H a mikrociny H47 a M, antimikrobiální látky inhibující růst jiných kmenů E. coli (Patzer a kol. 2003). Tyto látky však pravděpodobně neměly vliv na kompetici E. coli Nissle 1917 s ostatními kmeny (Hancock a kol. 2010a).

Druhý probiotický kmen E. coli 83972 rostl v moči lépe než UPEC kmen CFT073, kdežto v LB médiu to vypadalo přesně opačně. V MOPS médiu byl růst probiotika i UPEC kmenu vyrovnaný (Hancock a kol. 2010b). Tyto výsledky dokazují, že schopnost tvořit biofilm není přímo úměrná schopnosti kompetitovat s jinými kmeny a navíc, že výsledky kompetice jsou závislé na médiu, ve kterém k ní dochází (Hancock a kol. 2010a,b). Hancock a kol. (2010b) také prokázali, že u kmenů E. coli neexistuje rovnítko mezi úspěšným růstem v přisedlé a planktonní smíšené populaci.

4.2.3.Regulace tvorby biofilmu u Escherichia coli

Adheze i tvorba biofilmu je u E. coli regulována mnoha navzájem propojenými systémy. Patří mezi ně např. Cpx systém, který ovlivňuje prvotní adhezi buněk na substrát a rcs systém, jež má kromě adheze vliv také na tvorbu biofilmu. C-di-GMP (bis(3´-5´)-cyklický dimerní guanosinmonofosfát) podporuje tvorbu adhezinů a EPS a naopak inhibuje tvorbu bičíků a pilusů. Vliv na expresi curli a fimbrií typu 1 má také N-acetylglukosamin-6-fosfát. Tvorbu biofilmu ovlivňuje také ppGpp a pravděpodobně acetylfosfát (AcP). Do quorum sensing jsou zapojeny signální molekuly SdiA (homoserinový lakton) a AI-2 (autoinducer-2) (Beloin a kol. 2008).

Exprese genů v planktonních buňkách i v různých vývojových stádiích biofilmu se liší. U E. coli Nissle 1917 i 83972 bylo při tvorbě biofilmu v lidské moči exprimováno 277 specifických genů, jejichž exprese nebyla v planktonním stádiu zaznamenána. 150 z těchto genů kódovalo hypotetické proteiny. Byla pozorována také zvýšená exprese genů kódujících stresové faktory. U obou probiotických kmenů byly identifikovány také četné geny často spojované s virulencí. Byla zaznamenána jejich exprese, ze získaných dat se však nedá ověřit, zda jsou funkční (Hancock a kol. 2010b).