Probiotika, prebiotika a synbiotika

4.Srovnání konkrétních studií o tvorbě biofilmu u vybraných probiotických mikroorganismů

Jedna z požadovaných vlastností probiotických kmenů je jejich přežití a dočasná adheze ve střevech (viz kap. 2.3.1.). Adheze je také prvním krokem ke vzniku stabilnější vazby a tvorbě biofilmu. Vzhledem k počtu probiotických druhů (viz kap. 2.2.) je toto téma rozsáhlé, a proto jsem se blíže zabývala pouze laktobacily a bifidobakteriemi, které tvoří většinu mikroorganismů s klinicky ověřenými probiotickými účinky, a také dvěma probiotickými kmeny modelového organismu Escherichia coli. E. coli Nissle 1917 je kmen se klinicky potvrzenými zdraví prospěšnými účinky a je ve studiích zabývajících se probiotiky často zmiňován.

4.1.Laktobacili

Laktobacili jsou grampozitivní fakultativně anaerobní tyčky s nízkým obsahem gunanosinu a cytosinu v genomu. Přirozeně se vyskytují v rezidentní mikroflóře GIT, převážně v tenkém střevě, urogenitálního traktu a v orální dutině (Carr a kol. 2002, Pelletier a kol. 1997). Velkou část probiotik tvoří právě bakterie rodu Lactobacillus (Donohue 2006).

4.1.1.Vliv povrchových fyzikálních vlastností laktobacilů na jejich adhezi

Schopnost adheze závisí na mnoha faktorech. Nespecifická adheze je určována elektrostatickými silami a hydrofobicitou nebo hydrofilitou bakterie i substrátu, tu specifickou zprostředkovávají specifické molekuly (Pelletier a kol. 1997).

Pelletier a kol. (1997) se zabývali povrchovými vlastnostmi, které ovlivňují nespecifickou adhezi u třech druhů laktobacilů, L. casei subsp. casei, L. paracasei subsp. paracasei a L. rhamnosus. Zjištěný elektrostatický náboj buněk se lišil mezi kmeny i druhy a závisel na pH. Při zásaditém pH měl povrch všech studovaných kmenů mírně negativní náboj, který se při poklesu pH měnil na pozitivní. Nejvyšší elektronegativitu vykazovaly kmeny L. rhamnosus. Povrch všech studovaných druhů byl relativně hydrofilní a buňky měly zásaditý charakter. Metodou MATS (microbial adhesion to solvent test) bylo také zjištěno, že na adhezi laktobacilů se mohou kromě van der Waalsových sil podílet i acidobazické interakce. Muñoz-Provencio a kol. (2009) použili stejnou metodu ke zhodnocení povrchových vlastností některých kmenů L. casei. Ze sedmi kmenů čtyři byly silně hydrofobní a tři hydrofilní. Tři čtvrtiny studovaných kmenů měly zásaditý charakter.

Ehrmann a kol. (2002) analyzovali kmeny laktobacilů izolované z obilí a střevního traktu kachen. Všechny izolované kmeny, mezi nimiž se vyskytovaly druhy L. agilis, L. animalis, L. acidophilus, L. delbrueckii subsp. lactis, L. reuteri a L. salivarius, vykazovaly silně hydrofobní až hydrofobní vlastnosti a míra hydrofobicity korelovala s jejich schopností adheze. Naopak Muñoz-Provencio a kol. (2009) spojitost mezi hydrofobicitou (hydrofilitou) a adhezivními schopnostmi studovaných kmenů nepotvrdili.

Millsap a kol. (1997) popsali adhezi L. acidophilus, L. rhamnosus, L. plantarum a L. fermentum k hydrofilnímu substrátu (sklu) a hydrofobnímu povrchu (silikonové pryži) v moči nebo fosfátovém pufru (PBS) v průtokové kyvetě. Buňky L. acidophilus ATCC 4356 a L. fermentum B54 byly hydrofobní, mírně negativně nabité a při kultivaci v PBS dobře adherovali na sklo i pryž. Na sklo adherovalo větší množství buněk než na pryž, vazba však nebyla v tomto případě tak pevná jako při adhezi na pryž. Dva kmeny L. rhamnosus, druhý kmen L. fermentum a L. plantarum byly hydrofilní s vysokým negativním povrchovým nábojem a v PBS neadherovali ani na jeden ze substrátů. Kultivace v moči stimulovala u některých hydrofilních kmenů adhezi na sklo i pryž, vazba však byla u hydrofilních i hydrofobních kmenů slabá (Millsap a kol. 1997).

4.1.2.Adheze laktobacilů v gastrointestinálním traktu

K hodnocení schopnosti adheze LAB k biotickým povrchům byla vyvinuta řada in vitro systémů, které simulují vazbu k epiteliálním buňkám GIT. Příkladem jsou Caco-2 buňky (Jacobsen a kol. 1999) a IPEC-J2 buňky (Larsen a kol. 2009). In vitro se studuje také adheze ke střevní mukóze (Ouwehand a kol. 2001), složkám extracelulární matrix i resektované střevní tkáni. In vitro systémy sice nezohledňují komplexní děje probíhající v GIT, ale ve většině případů odrážejí schopnosti bakterií in vivo. Nejreálnější imitaci prostředí ve střevním traktu představují studie s resektovanou střevní tkání (Muñoz-Provencio a kol. 2009).

Larsen a kol. (2009) studoval adhezi in vitro k IPEC-J2 buňkám u několika probiotických kmenů laktobacilů. Adhezi bakterií v tomto případě nejvíce ovlivňují muciny, které IPEC-J2 buňky produkují. Larsen a kol. (2009) prokázal nejsilnější adhezi u kmenů L. rhamnosus 19070 a L. reuteri 12246. Nejslabší vazbu vykazoval L. casei F19. Adhezi k Caco-2 buňkám ve své studii hodnotili Tuomola a Salminen (1998). Největší adhezi pozorovali u kmenů L. casei (Fyos®), L. acidophilus 1, L. rhamnosus LC-705 a GG. Greene a Klaenhammer (1994) prokázali adhezi k Caco-2 buňkám u L. acidophilus BG2FO4 a NCFM/N2 a L. gasseri ADH izolovaných z člověka.

Míra adheze laktobacilů k Caco-2 buňkám závisí mimo jiné na koncentraci bakterií (Greene a Klaenhammer 1994, Tuomola a Salminen 1998). Schopnost adheze se liší mezi jednotlivými kmeny, je nezávislá na druhu (Jacobsen a kol. 1999) a vliv na ní má též hodnota pH (Greena a Klaenhammer 1994, Granato a kol. 1999, Granato a kol. 2004).

Schopnost adheze k epiteliálním buňkám však neznamená, že laktobacili po podání v hostiteli natrvalo kolonizují střevo (Jacobsen a kol. 1999). Alander a kol. (1999) u L. rhamnosus GG potvrdil, že adheze ke střevní sliznici in vivo je jen dočasná. Bakterie se sice ve střevě dělí, dělení ale pouze částečně vyrovnává odlučování svrchních vrstev střevních buněk s adherovanými laktobacily. Navíc, probiotický kmen ve střevě čelí silné kompetici. Pokud tedy není množství laktobacilů zvyšováno uměle jejich podáváním zvenku, probiotikum obvykle ze střeva postupně vymizí (Alander a kol. 1999).

4.1.3.Adheziny

Důležitou roli při adhezi laktobacilů v GIT hrají pravděpodobně různé makromolekuly na povrchu bakteriálních buněk. Vazba ke střevní sliznici je často zprostředkována bílkovinami (Coconnier a kol. 1992, Roos a Jonsson 2002, Granato a kol. 2004, Pretzer a kol. 2005), mohou se však na ní podílet i sacharidy, které byly zjištěny u L. fermentum 104-S (Henriksson a Conway 1996) či lipoteichoové kyseliny jako třeba u L. johnsonii La1 (Granato a kol. 1999). Také adhezi k různým složkám extracelulární matrix v lidském organismu, kterou tvoří proteiny jako třeba laminin, kolagen, fibrinogen a fibronektin, umožňují povrchové proteiny zjištěné např. u L. acidophilus CRL 639 (Lorca a kol. 2002) a kmenů L. casei (Muñoz-Provencio a kol. 2009). U L. rhamnosus GG byly charakterizovány dva adheziny. Prvním je pilin SpaC, který se nachází na špičce pilusů a sporadicky také na zbytku těchto struktur. Tento protein zprostředkovává adhezi ke střevní sliznici člověka, jež je u L. rhamnosus LC705, který tento pilin netvoří, snížená (Kankainen a kol. 2009). Druhý adhezin, protein LGG_01865 charakterizovali Vélez a kol. (2010). Poté, co pili umožní prvotní kontakt, LGG_01865 hraje roli při tvorbě pevnější vazby s biotickým i abiotickým povrchem. Proto také Vélez a kol. (2010) pro tuto bílkovinu navrhli název MabA (modulator of adhesion and biofilm).

4.1.4.Tvorba biofilmu a vliv podmínek vnějšího prostředí

Jedním z nejlépe prostudovaných probiotických kmenů je L. rhamnosus GG. Váže se k epiteliálním buňkám (Tuomola a Salminen 1998) i ke střevní sliznici in vitro. Byla prokázána i jeho adheze ke střevní sliznici u člověka in vivo. Navíc jeho přítomnost ve střevě byla prokázána i déle než týden po ukončení jeho orálního podávání (Alander a kol. 1999). Tvorbu biofilmu studovali Lebeer a kol. (2007a, 2007b). Vznik biofilmu byl prokázán na polystyrenových hrotech proti kusu mikrotitrační destičky v mTSB (minimal tryptone soya broth) a AOAC (folic acid medium) médiu za mikroaerobních i anaerobních podmínek. Biomasa biofilmu v mTSB médiu byla asi o 20 % větší než v AOAC médiu. Biofilm se tvořil také v MRS médiu bez glukózy. Inhibiční efekt glukózy na vznik biofilmu u L. rhamnosus GG byl prokázán také jejím přidáním do mTSB média. U jiných kmenů L. rhamnosus nebo L. casei však glukóza tvorbu biofilmu neinhibovala (Lebeer a kol. 2007b).

V MRS médiu tvořily biofilm také různé kmeny L. reuteri (Jones a Versalovic 2009). L. plantarum subsp. plantarum JCM1149, L. brevis JCM1059 a L. fructivorans JCM1117 tvořili biofilm v MRS bujónu na skleněných sklíčkách v mikrotitrační destičce (Kubota a kol. 2008).

Lebeer a kol. (2007b) prokázali, že tvorba biofilmu u L. rhamnosus GG závisí na kultivačním médiu a podmínkách ve vnějším prostředí. Např. MnSO₄, který ovlivňuje elektrostatické síly na povrchu buněk, inhiboval vznik biofilmu. Růst bakterií v biofilmu potlačovalo také nízké pH. Naopak růst bakterií v suspenzi byl nízkým pH inhibován méně a MnSO₄ jejich růst dokonce podporoval (Lebeer a kol. 2007b).

Prebiotika odvozená od inulinu (především polysacharidy s dlouhým řetězcem) růst biofilmu u L. rhamnosus GG podněcovala (Lebeer a kol. 2007b). L. rhamnosus GG tyto polysacharidy sice nefermentuje (Kaplan a Hutkins 2000), ale je možné, že je inkorporuje do extracelulární matrix. Tvorbu biofilmu podporovaly také žlučové kyseliny při nízkých koncentracích (až 0,05%). S jejich rostoucí koncentrací však tvorba biofilmu rychle klesala. Laktoferin, peptid s antimikrobiálními účinky produkovaný epitelem a neutrofily, neměl na vývoj biofilmu žádný vliv (Lebeer a kol. 2007b). Zvýšenou rezistenci biofilmu ke stresovým faktorům zjistili také Kubota a kol. (2008) u L. plantarum subsp. plantarum JCM1149. Biofilm byl rezistentnější ke kyselině octové o koncentracích 8 %, 10 % a 11 % a vykazoval odolnost vůči 30% a 40% ethanolu na rozdíl od planktonních buněk.

Podobně jako L. rhamnosus GG tvoří biofilm na polystyrenu také různé kmeny L. reuteri. U jejich biofilmu byly, jako dříve u planktonních buněk, prokázány probiotické účinky i produkce reuterinu (Jones a Versalovic 2009), antimikrobiálního faktoru inhibujícího grampozitivní i gramnegativní bakterie, kvasinky a protozoa (Talarico a Dobrogosz 1989). Růst biofilmu, probiotické účinky i tvorba reuterinu se mezi jednotlivými kmeny lišily (Jones a Versalovic 2009). Vznik biofilmu u kmenů L. reuteri izolovaných z myšího střeva na plastových kuponech pozorovali Tannock a kol. (2005).

4.1.5.Extracelulární polysacharidy

Na tvorbě biofilmu se podílí extracelulární polysacharidy sekretované bakteriálními buňkami (viz kap. 3.2.2.). Dosud byly popsány kmeny u přibližně třiceti druhů laktobacilů, které produkují EPS s velkou strukturální rozmanitostí. Patří mezi ně L. casei, L. acidophilus, L. brevis, L. curvatus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. helveticus, L. rhamnosus, L. plantarum, L. johnsonii a další (Badel a kol. 2010). EPS sekretované laktobacily se dělí na homopolysacharidy a heteropolysacharidy. Homopolysacharidy jsou tvořeny jedním druhem monosacharidů, v případě laktobacilů glukózou nebo fruktózou, a v heteropolysacharidech je obsaženo více druhů monosacharidů. EPS mají vliv na adhezi laktobacilů, byly popsány jejich účinky na strukturu a složení mléčných výrobků a některé jsou také studovány jako potenciální prebiotika (Badel a kol. 2010). Sekrece EPS u kmene L. rhamnosus GG závisí na kultivačních podmínkách i růstovém médiu. Největší produkce EPS byla pozorována v AOAC médiu, biofilm se však tvořil lépe v mTSB médiu (Lebeer a kol. 2007b).

4.1.6.Quorum sensing

Při vzniku biofilmu hraje velkou roli také quorum sensing (viz kap. 3.5.). Významné postavení v QS má LuxS/AI-2 systém. AI-2 (autoinducer-2) je považována za relativně univerzální signální molekulu, jejíž tvorba je katalyzována enzymem LuxS. Ortologní geny luxS byly popsány u řady grampozitivních i gramnegativních bakterií (Sun a kol. 2004). Identifikovány byly také u L. rhamnosus GG (Lebeer a kol. 2007), L. reuteri 100-23 (Tannock a kol. 2005), L. casei, L. gasseri, L. delbrueckii (Rodionov a kol. 2004), L. acidophilus NCFM (Altermann a kol. 2005), L. plantarum WCFS1, Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 a Bifidobacterium longum NCC2705 (Sun a kol. 2004). U L. rhamnosus GG LuxS podmiňuje tvorbu biofilmu na polystyrenovém povrchu. Gen luxS má velký vliv i na metabolismus a inhibice tvorby biofilmu u bakterií s mutantním genem luxS má pravděpodobně metabolickou příčinu (Lebeer a kol. 2007a). Tannock a kol. (2005) pozoroval, že inaktivace genu luxS měla zásadní účinky na chování L. reuteri 100-23C v GIT myší.

4.1.7.Koagregace

Zajímavým jevem je schopnost některých mikroorganismů tvořit agregáty s geneticky odlišnými druhy (kmeny). Tato vlastnost by mohla být velkou výhodou i při kompetici probiotik s ostatními bakteriemi ve střevním traktu. Agregace probiotik s potenciálními střevními patogeny by také mohla zvyšovat účinnost těchto probiotických bakterií (Collado a kol. 2007). Collado a kol. (2007) testovali schopnost agregace probiotických kmenů L. rhamnosus GG a Bifidobacterium lactis Bb12 s patogenní Escherichia coli K2 a Salmonella enterica subsp. enterica sv. Typhimurium ATCC 12028. Po dvacetihodinové inkubaci agregovaly oba testované probiotické kmeny s danými patogeny. Koagregace byla závislá na době a podmínkách kultivace a mezi kmeny se lišila. Cesena a kol. (2001) pozorovali schopnost koagregace neprobiotického kmene L. crispatus M247 s různými kmeny enterokoků a dalšími kmeny laktobacilů.