B- limfotsitlarni EAC-rozetka usulida aniqlash
Bu usul odam qonidagi B-Iimfotsitlarni aniqlashdagi eng oddiy usullardan biri hisoblanadi. B-limfotsitlar membranasida komplementning C3 fraksiyasiga retseptor mavjud, reaksiya shu komplementni B- limfotsitlar tomonidan biriktirib olishga asoslangan. B-limfotsitlar C3 komplementni biriktirib olsa, reaksiya ko'zga ko'rinmaydi. Reaksiya ko'rinishi uchun komplement eritrotsitlarga adsorbtsiyalanadi.
Komplementning eritrotsitar antitela kompleksini tayyorlash.
odam eritrotsitlari (1-gruppa va rezus manfiy) uch marotaba 199 oziqli muhitda sentrifugada yuviladi( 1000 ayln/daq.).
yuvilgan eritrotsitning 2,5% aralashmasidan 2 ml olinadi va subagglyutinatsiyagacha nisbatan suyultirilgan quyonning qon zardobi teng miqdorda qo'shiladi va 30 daqiqa 37°C termostatda saqlanadi.
v) aralashmaga 0,1 ml sichqonning normal qon zardobidan tomiziladi (komplement manbasi) va 30 daqiqa yana termostatda saqlanadi.
g) aralashma bir marotaba 199 oziqli muhit bilan 800 ayln/daq., 5 daqiqa sentrifugada yuviladi. Komplement biriktirilgan eritrotsitning 1 ml dagi miqdori 100xl06 ga yetkaziladi.
EAC-rozetkani qo'yish. 0.1 ml limfotsit aralashmasiga 0,1 ml 1% komplement biriktirilgan eritrotsitlar qo'shiladi, aralashma 5 daqiqa 37°C termostatga qo'yiladi, so'ngra 800 ayln/daq., 5 daqiqa sentrifuga qilinadi va 0-4°C muzlatkichda 30-60 daqiqa saqlanadi. Qolgan bosqichlari T- limfotsitlarni aniqlash kabi qo'yiladi. Komplement biriktirilgan eritrotsitlar komplementga retseptor bo'lgan B- limfotsitlarga tanlab birikib, rozetka hosil qiladi. Sog'lom odamlarda B-limfotsitlarning bu populyatsiyasi 15-25% tashkil qiladi.
Oxirgi yillarda limfotsitlar tarkibidagi maxsus antigen determinant- larga qarshi monoklonal antitelalar (mAT) ishlab chiqarilmoqda. Bulardan CD (klaster differensirovki) differensiyalanovchi monoklonal antitelalar kolleksiyasi bo'lib, limfotsitlar membranasidagi maxsus biomolekula markerlarni aniqlaydi. Bu mAT yordamida oqib o'tuvchi sitoflyuorimetriya yoki flyuroxrom bilan nishonlangan AT bilan immunoflyuorissensiya usulida T va В limfotsitlar, ularning subpopulyatsiyalarini aniqlash yo'lga qo'yilgan. Lekin shuni aytish zarurki, yuqorida keltirilgan usullarni qo'llash uchun laboratoriyalarda maxsus apparaturalar va reaktivlar zarur. Oxirgi yillarda vatanimiz olimlari tomonidan monoklonal antitelalar yordamida bilvosita rozetka hosil qilish usuli yordamida T-, В va tabiiy killer hujayralariga baho berish yo'lga qo'yilgan.
Immunokompetent hujayralarni monoklonal antitelalar bilan bilvosita rozetka hosil qilish usulida aniqlash.
Usulning mohiyati shundan iboratki, limfotsitlar monoklonal antitela retseptori bo'lsa, yuzasida mAT bo'lgan eritrotsitlarni biriktirib, rozetka hosil qiladi. Bu usul o'zining oson qo'yilishi, yetarli maxsusligi bilan ajralib turadi va klinik laboratoriyalarda keng qo'llanib kelinmoqda. Hozirgi kunda ko'proq quyidagi immunkompetent limfotsit hujayralaming markerlari mAT lar bilan aniqlandi. CD3 - T-limfotsitlar, CD4 - xelper/induktorlar, CDS - T supressor/tsitotoksik limfotsitlar, CD 19
B-limfotsitlar, CD 16 - tabiiy killerlar. Qo'llanilayotgan usulda ООО Sorbent, Rossiya (Moskva) ishlab chiqargan monoklonal antitelalardan foydalanish mumkin.
Immunokompetent hujayralarni aniqlash uchun mAT li eritrotsitar diagnostikumlar tayyorlash.
T-limfotsitlami (CD3) eritrotsitar diagnostikumi quyidagi usullarda tayyorlandi. 1% odamni I (0) guruh Rh(-) eritrotsitlariga (0,1ml) 5mkl monoklonal antitela va ustiga 50 mkl 0,3% xlorid xrom eritmasi qo'shildi. Hosil bo'lgan suspenziya 5 daqiqa silkitib turilib, uch marotaba sentrifugada 1500 ayln/daq. fiziologik eritmada yuviladi. So'ngra suspenziya 5 daqiqa 1% albumin eritmasida (nospetsifik reaksiyalarning oldini olish uchun) inkubatsiya qilinib, 2 marotaba fiziologik eritmada sentrifugada 1500 ayln/daq. qayta yuviladi va eritrotsitar diagnos- tikumning ishchi konsentratsiyasi 2,5% yetkaziladi. Shunday usulda CD4
xelper/induktorlar, CD8 - T supressor/sitotoksik limfotsitlar, CD19 - P-limfotsitlar, CD16 - tabiiy killerlar o'zlariga mos monoklonal antitelalar qo'llanilib tayyorlanadi.
Har bir limfotsitlarga baho berish quyidagicha amalga oshiriladi. Limfotsitlar ishchi suspenziyasi va har bir tayyorlangan monoklonal antitelali diagnostikumdan 0,1 ml olinib, aralashtirildi va 800 ayln/daq. sentrifuga qilinib, 1 soat muzlatkichda saqlanadi. Suspenziya sekin-sekin silkitib, resuspenziya qilinadi va rozetkalar stabil bo'lishi uchun 2,5% gulitar aldegid eritmasi tomizilib, cho'kmadan surtma tayyorlanadi.
Dostları ilə paylaş: |
