Microsoft Word 63770195-file00

35 

 

Waterman-Storer CM, Salmon ED (1998) How microtubules get fluorescent speckles. 

882 

Biophys J 75: 2059-2069 

883 

Westphal V, Rizzoli SO, Lauterbach MA, Kamin D, Jahn R, Hell SW (2008) Video-rate far-

884 

field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement. Science 320: 246-249 

885 

Wightman R, Turner SR (2007) Severing at sites of microtubule crossover contributes to 

886 

microtubule alignment in cortical arrays. Plant J 52: 742-751 

887 

Zanic M, Widlund PO, Hyman AA, Howard J (2013) Synergy between XMAP215 and EB1 

888 

increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol 15: 688-693 

889 

Zhang D, Wadsworth P, Hepler PK (1990) Microtubule dynamics in living dividing plant 

890 

cells: confocal imaging of microinjected fluorescent brain tubulin. Proc Natl Acad Sci USA 87: 

891 

8820-8824 

892 

Zhang H, Dawe RK (2011) Mechanisms of plant spindle formation. Chromosome Res 19: 335-

893 

344 

894 

Zucker RM, Price OT (1999) Practical confocal microscopy and the evaluation of system 

895 

performance. Methods 18: 447-458 

896 

897 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

36 

 

Figure legends 

898 

Figure 1: Comparison of SIM, WF and CLSM in resolving fine details of cortical microtubule 

899 

organization in hypocotyl epidermal cells of Arabidopsis thaliana expressing either GFP-MBD 

900 

or GFP-TUA6 microtubule markers. (A) Overview of bundled GFP-MBD-labeled microtubules 

901 

in a hypocotyl epidermal cell of wild type Arabidopsis thaliana (see also Fig. S1A). The boxed 

902 

area includes a loop within a bundle which is readily visible by SIM (top inset, arrow), but not by 

903 

WF (middle inset, arrow; Fig. S1B) or CLSM (bottom inset, arrow; Fig. S1C). (B) Overview and 

904 

detail of a cortical microtubule bundle in an epidermal cell expressing TUA6-GFP (Fig. S1D). 

905 

Top inset shows the discontinuous incorporation of the tagged tubulin revealed by SIM which is 

906 

however not discernible by WF (bottom inset; see also Fig. S2A to S2C). (C) Overview and 

907 

details of microtubule branch formation and release in a hypocotyl epidermal cell expressing 

908 

GFP-MBD microtubule marker (Fig. S1F) acquired with a 63

×1.40NA oil immersion objective. 

909 

A nascent branch (top inset, arrow) and a newly released branch (top inset, arrowhead) are 

910 

clearly visible by SIM, but not by WF (bottom inset, respective arrow and arrowhead). (D) 

911 

Microtubule bundle complexity in a hypocotyl epidermal cell of the mpk4 mutant as visualized 

912 

by SIM (Fig. S1J). Such bundles (white boxed area in D) can be resolved in detail by SIM (top 

913 

inset) but not by WF (middle inset) or CLSM (bottom inset). (E to G) Details (left column) and 

914 

orthogonal projection (right column) of three closely proximal microtubules (lines in E to G) 

915 

from the dotted boxed area in (D). By SIM (E; Fig. S1J) the three microtubules are clearly 

916 

separated as three fluorescent spots, while in the respective WF (F; Fig. S1K) and CLSM (G; 

917 

Fig. S1L) images the three microtubules appear as a fuzzy fluorescent area. (H to K) 

918 

Quantitative analysis of the resolution of individual GFP-MBD (H, J) or GFP-TUA6 (I, K) 

919 

labeled microtubules by means of SIM and WF (H, I) or CLSM (J, K). The graphs represent 

920 

averaged, co-aligned and normalized intensity profiles (as described in Materials and Methods 

921 

section) of individual cortical microtubules (n= 27 and 42 for SIM (GFP-MBD and GFP-TUA6 

922 

respectively), 27 and 42 for WF (GFP-MBD and GFP-TUA6 respectively) and 27 and 47 for 

923 

CLSM (GFP-MBD and GFP-TUA6 respectively)). Scale bars: 5 

μm (A to G), 2 μm (insets of A 

924 

to C). 

925 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

37 

 

Figure 2: Quantitative analysis of GFP-MBD-labeled cortical microtubule bundles by means of 

926 

absolute fluorescence intensity comparing the resolution capacity of SIM, WF and CLSM. (A to 

927 

C) SIM overview (A; Fig. S4A) of an area with microtubule bundles with different microtubule 

928 

numbers (1, blue line; 2, green line; 3, red line and 4, purple line) quantified by means of 

929 

fluorescence intensity profiling (B) corresponding to the colored lines in (A) and quantitative 

930 

evaluation of microtubule number per bundle (C; mean

±SD; R

2

, linear correlation coefficient; *, 

931 

p<0.001; n=119, 99, 33, and 26 measurements for one, two, three, and four microtubules, 

932 

respectively). (D to F) The same area shown in (A) after WF acquisition (D; Fig. S4B) with the 

933 

representative (E) and the averaged maximum fluorescence intensities intensities (F; mean

±SD; 

934 

R

2

, linear correlation coefficient; *, p<0.001 comparing 1 with 2 and 2 with 3 microtubules; N.S. 

935 

non-significant difference (p=0,158 between 3 and 4 microtubules); n=119, 99, 33, and 26 

936 

measurements for one, two, three, and four microtubules, respectively). (G to I) CLSM imaging 

937 

(G; Fig. S4C) of the same area depicted in (A) showing the representative (H) and the averaged 

938 

(I; mean

±SD; R

2

, linear correlation coefficient; *, p<0.001 comparing 1 with 2 microtubules; 

939 

N.S. non-significant difference (p=0,057 between 2 and 3 microtubules and 0.051 between 3 and 

940 

4 microtubules); n=119, 99, 33, and 26 measurements for one, two, three, and four microtubules, 

941 

respectively) fluorescence intensities corresponding to increasing microtubule numbers per 

942 

bundle.  (J to L) Detailed view (J) of the boxed area in (A) and the fluctuation of absolute 

943 

fluorescence intensities along the longitudinal profile (represented by red, tan and orange 

944 

brackets in J; white arrow points to fluorescence intensity depression between red and tan 

945 

brackets) by SIM, WF (K) and CLSM (L). Brackets in (K, L) correspond to the fluorescence of 

946 

the respective brackets in (J). Note that the intensity along the red and the tan bracket is well 

947 

discriminated in SIM, declining incrementally (K), less discriminated in WF declining nearly 

948 

linearly (K) and not discriminated at all in CLSM (L). Black arrows in (K, L) correspond to the 

949 

intensity drop marked with white arrow in (J).  Scale bars: 5 

μm (A, D, G) and 2.5 μm (J). For 

950 

clarity the colored line bars in A, D, G, corresponding to the fluorescence intensity profiles 

951 

plotted in B, E, H are twice as long as the actual profile length.     

952 

     

953 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---