Microsoft Word 63770195-file00

38 

 

Figure 3: Resolution of proximal cortical microtubules labeled with GFP-MBD microtubule 

954 

marker, comparing SIM, WF and CLSM. (A to C) The same cortical area of a hypocotyl 

955 

epidermal cell expressing GFP-MBD fusion protein showing two adjacent microtubules by SIM 

956 

(A; full view in Fig. S5A), WF (B; full view in Fig. S5B) and CLSM (C; full view in Fig. S5C). 

957 

(D to F) Normalized fluorescence intensity profiles corresponding to white lines in (A to C), 

958 

showing clear discrimination of the two adjacent microtubules as two peaks in SIM (D) in 

959 

contrast to the fluorescence intensity profiles obtained from the respective WF (E) and CLSM 

960 

(F) acquisitions showing only one peak. (G to I) Different areas from the same cell visualized 

961 

with SIM (G; full view in Fig. S5D), WF (H; full view in Fig. S5E) and CLSM (I; full view in 

962 

Fig. S5F). White lines across adjacent microtubules represent the position from which 

963 

fluorescence intensity profiles were acquired and correspond to the Rayleigh resolution limit 

964 

(i.e., peak-to-peak discrimination at ca. 25% depression of maximum fluorescence intensity). (J 

965 

to L) Quantitation of the corresponding intensity profiles shown in (G to I). Brackets denote the 

966 

peak-to-peak separation at the Rayleigh limit. (M) Graph depiction of the averaged Rayleigh 

967 

limits measured for SIM, WF and CLSM (mean

±SD, n=32 measurements in all cases; *, 

968 

p<0.001 comparing Rayleigh limits from SIM with WF and CLSM). Scale bars for all Figures: 5 

969 

μm.     

970 

Figure 4: Resolution of individual cortical microtubules of Arabidopsis thaliana hypocotyl 

971 

epidermal cells, labeled with GFP-MBD (A, C, E, G, I) or GFP-TUA6 (B, D, F, H, J) during 

972 

time-lapsed imaging with SIM (A, B), WF (C, D), CLSM (E, F), TIRF (G, H) and SD (I, J) 

973 

microscopies. Scatter plots represent averaged weighted profiles of many individual 

974 

microtubules. (A, B) Resolution of individual cortical microtubules labeled with GFP-MBD (A; 

975 

n=40) and GFP-TUA6 (B; n=71) after SIM imaging. (C, D) Resolution of individual cortical 

976 

microtubules labeled with GFP-MBD (C; n=40) and GFP-TUA6 (D; n=71) after WF imaging. 

977 

(E, F) Resolution of individual cortical microtubules labeled with GFP-MBD (E; n=41) and 

978 

GFP-TUA6 (F; n=43) after CLSM imaging. (G, H) Resolution of individual cortical 

979 

microtubules labeled with GFP-MBD (G; n=41) and GFP-TUA6 (H; n=47) after TIRF imaging. 

980 

(I, J) Resolution of individual cortical microtubules labeled with GFP-MBD (I; n=54) and GFP-

981 

TUA6 (J; n=83) after SD imaging. Black lines are positioned to a normalized fluorescence 

982 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

39 

 

intensity (0.5) corresponding to the FWHM of each respective curve. Scale bars for all Figures: 5 

983 

μm. 

984 

Figure 5: Independent and intrabundle dynamics of GFP-MBD and GFP-TUA6-labeled cortical 

985 

microtubules visualized by SIM. (A to C) Overview (A) of a hypocotyl epidermal cell 

986 

expressing GFP-MBD microtubule marker during time-lapsed imaging with SIM, selected stills 

987 

of a free microtubule visible at both ends (right boxed area in A; B) and respective kymograph of 

988 

the same microtubule exhibiting short length transitions of growth and shrinkage (full 

989 

arrowheads; C). (D) Kymograph representing dynamics of free cortical microtubule (corresponds 

990 

to Figs. S6A, B; Video S1) visible at one end showing smooth, uninterrupted growth (solid lines) 

991 

and shrinkage (catastrophe; dotted line). (E to G) Overview (E) of a hypocotyl epidermal cell 

992 

expressing GFP-TUA6 microtubule marker, selected stills of a fully visible independent 

993 

microtubule (boxed area in E; F; arrowheads point to plus end; Video S2) and respective 

994 

kymograph showing dark and bright striations owing to the inhomogeneous incorporation of 

995 

GFP-TUA6 in the microtubule lattice (G). (H) Another kymograph of a GFP-TUA6-labeled 

996 

microtubule where minus end behavior can be followed (corresponds to Figs. S6C, S6D). (I) 

997 

Selected stills of a microtubule growing within a bundle from the top right boxed area in (A). (J) 

998 

The respective kymograph showing vigorous plus end dynamics and short length excursions in 

999 

the plus end (arrowheads) and minimal dynamics at the minus end. (K) Longitudinal 

1000 

fluorescence intensity profile along the bundle encompassing the microtubule tracked in (I). (L) 

1001 

selected stills of a short intrabundle microtubule (arrowheads) selected from the left boxed area 

1002 

of (A). (M) The corresponding kymograph of the microtubule in (L) showing frequent and short 

1003 

length transitions in the plus end (full arrowheads) and dynamic instability at the minus end 

1004 

(open arrowheads). (N) The longitudinal fluorescence intensity profile harboring the short 

1005 

intrabundle microtubule depicted in (L). (O, P) Graphs depicting average plus and minus end 

1006 

growth and shrinkage rates reported for GFP-MBD and GFP-TUA6 labeled extrabundle (O) and 

1007 

intrabundle (P) microtubules from values summarized in Tables S1 and S3 for free and 

1008 

intrabundle microtubules respectively. All full arrowheads point to plus ends and all open 

1009 

arrowheads point to minus ends. Scale bars: 5 

μm (A, E), 2 μm (B, F, G, L), 1 μm (C, D, I, J, M) 

1010 

and 0.5 

μm (H). Time bars in kymographs: 127.85s (C), 80s (M), 60s (J) 34.5s (D), 30s (G) and 

1011 

10s (H). (+) indicate microtubule plus ends and (-) indicate microtubule minus ends. Numbers in 

1012 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

40 

 

(B, F, I, L) are in min:sec.msec. In all kymographs (C, D, G, H, J, M) time evolution is from top 

1013 

to bottom. 

1014 

Figure 6: Overview of independent cortical microtubule dynamics of hypocotyl epidermal cells 

1015 

of the mpk4 mutant expressing GFP-MBD fusion protein, as visualized by SIM and quantified 

1016 

accordingly. (A to C) Widefield SIM view (A), selected stills (B) from the boxed area in (A) and 

1017 

respective kymograph showing a shrinkage (C, dotted line) and a successive growth event (C, 

1018 

full line). (D) Another kymograph of a free growing microtubule showing two growth phases 

1019 

with different rate (full lines) interrupted by one catastrophe (dotted line). Arrowheads denote 

1020 

minor such transitions. (E) Graphic illustration of plus and minus end dynamics of free 

1021 

microtubules observed by SIM in hypocotyl epidermal cells of GFP-MBD-transformed mpk4 

1022 

mutants as summarized in Table S1. Scale bars: 5 

μm (A), 2 μm (B), and 1 μm (C, D). Time bars 

1023 

in (C, D) 60 s. (+) indicate microtubule plus ends. Numbers in (B) are in min:sec.msec. In all 

1024 

kymographs (C, D) time evolution is from top to bottom. 

1025 

Figure 7: Intrabundle microtubule dynamics of the GFP-MBD expressing mpk4 mutant as 

1026 

acquired with SIM. (A) Overview (A; see also Video S3) of an mpk4 hypocotyl epidermal cell 

1027 

with GFP-MBD-labeled microtubules, exhibiting extensive cortical microtubule bundling (boxed 

1028 

areas).  (B) Selected stills of a short microtubule (from left bottom boxed area in A; open 

1029 

arrowheads) growing on the tip of a cortical microtubule bundle. From the same bundle a free 

1030 

microtubule extends away by its plus end (red arrowhead). Temporal changes of the longitudinal 

1031 

profile illustrated in H, can be seen in Fig. S (C) Selected stills from the right boxed area in (A) 

1032 

of a microtubule bundle showing two discrete short microtubules (denoted by orange and white 

1033 

full arrowheads respectively). Red full arrowhead shows depolymerizing microtubule in the 

1034 

same bundle and full and open blue arrowheads show a short gap visible as a steep fluorescence 

1035 

intensity depression in (I). (D) Selected stills of a short microtubule growing (full arrowheads) 

1036 

upon a bundle from the top left boxed area in (A). (E to G) Kymographs corresponding to B (E), 

1037 

C (F) and D (G) respectively. Arrowheads in (E to G) are tracking the respective positions shown 

1038 

in (B to D). (H to J) Longitudinal fluorescence intensity profiles drawn along the microtubule 

1039 

bundles depicted in the last frames of B (H), C (I) and D (J). (K) Vertical fluorescence intensity 

1040 

profiles corresponding to the colored lines in the last frame of (B; blue line, 1 microtubule; green 

1041 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

41 

 

line, 2 microtubules; red line, three microtubules) demonstrating the complexity of the respective 

1042 

bundle.  (L) Graph depiction of plus and minus end intrabundle microtubule dynamics in the 

1043 

mpk4 mutant as summarized in Tables S3 and S4. Scale bars: 5 

μm (A), 2 μm (B to D), 1 μm (F) 

1044 

and 0.5 

μm (E, G). Time bars in kymographs: 35 s (E to G). Numbers in B to D min:sec.msec. In 

1045 

all kymographs (E to G) time evolution is from top to bottom. 

1046 

Figure 8: Lateral-tip interaction between aberrant, short and rigid microtubule bundles with the 

1047 

walls of individual microtubules labeled with GFP-MBD marker in mpk4 mutant as visualized 

1048 

by SIM.  (A to D) Overview of hypocotyl epidermal cell of mpk4 mutant expressing GFP-MBD 

1049 

fusion protein as in Fig. 7A (A; see also Video S3), and time series of two short and rigid 

1050 

microtubule bundles (from boxed area in A; (B) First bundle (full arrowhead) shows short range 

1051 

rapid gliding along the mother microtubule. Second bundle (open arrowhead) swings freely and 

1052 

randomly around its stable anchorage on the site of the mother microtubule. (C, D) Respective 

1053 

kymographs of the short, rigid bundles shown with full and open arrowheads in (B) to 

1054 

demonstrate their rapid, random motility while maintaining stable attachments (C, arrowhead 

1055 

shows the tip of the rigid bundle pointed by open arrowhead in B as it approaches an opposing 

1056 

microtubule (arrow in B, asterisk in C); arrowhead shows to back and forward gliding 

1057 

transitions).  (E, F) Absolute fluorescence intensity profiling (dark grey in E and F) of the 

1058 

microtubule bundle (open arrowhead in B) referenced against single microtubule (light grey in E 

1059 

and F). Fluorescence intensity of bundle is about 3-fold increased compared to that of the 

1060 

individual microtubule suggesting it comprises of three microtubules. Scale bars: 5 

μm (A), 1 μm 

1061 

(B, E), 0.5 

μm (C, D). Numbers on time frames time in min:sec.msec. Time bars in kymographs 

1062 

(35.16s). In all kymographs (C, D) time evolution is from top to bottom. 

1063 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

0

2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

2:41.608 

2:09.290 

1:36.968 

1:04.647 

32.325 

Figure 7: Intrabundle microtubule dynamics of the GFP-MBD expressing mpk4 mutant as acquired with SIM. (A) Overview (A; see also Video S3) of an mpk4 

hypocotyl epidermal cell with GFP-MBD-labeled microtubules, exhibiting extensive cortical microtubule bundling (boxed areas). (B) Selected stills of a short 

microtubule (from left bottom boxed area in A; open arrowheads) growing on the tip of a cortical microtubule bundle. From the same bundle a free microtubule 

extends away by its plus end (red arrowhead). Temporal changes of the longitudinal profile illustrated in H, can be seen in Fig. S (C) Selected stills from the 

right boxed area in (A) of a microtubule bundle showing two discrete short microtubules (denoted by orange and white full arrowheads respectively). Red full 

arrowhead shows depolymerizing microtubule in the same bundle and full and open blue arrowheads show a short gap visible as a steep fluorescence intensity 

depression in (I). (D) Selected stills of a short microtubule growing (full arrowheads) upon a bundle from the top left boxed area in (A). (E to G) Kymographs 

corresponding to B (E), C (F) and D (G) respectively. Arrowheads in (E to G) are tracking the respective positions shown in (B to D). (H to J) Longitudinal 

fluorescence  intensity  profiles  drawn  along  the  microtubule bundles  depicted in  the last  frames  of  B  (H),  C  (I)  and  D  (J).  (K) Vertical  fluorescence  intensity 

profiles  corresponding  to  the  colored  lines  in  the  last  frame  of  (B;  blue  line,  1  microtubule;  green  line,  2  microtubules;  red  line,  three  microtubules) 

demonstrating  the  complexity  of  the  respective  bundle.  (L)  Graph  depiction of  plus  and  minus  end  intrabundle  microtubule  dynamics  in  the  mpk4  mutant  as 

summarized in Tables S3 and S4. Scale bars: 5 

μm (A), 2 μm (B to D), 1 μm (F) and 0.5 μm (E, G). Time bars in kymographs: 35 s (E,F,G). Numbers in B to D 

min:sec.msec. In all kymographs (E to G) time evolution is from top to bottom. 

A

bs

ol

ut

e

 i

nt

ens

it

y

 

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

0

300

600

900

1200

1500

Profile length [nm] 

1 MT 

2 MTs 

3 MT 

SIM 

1:04.647 

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

0

2000

4000

6000

8000 10000 12000

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

-2

0

2

4

6

+ end

 

- end

 

shrinkage

 

growth 

mpk4 

 

μ

m/

mi

n

 

a 

A 

G 

E 

F 

B 

0.000 

32.325 

1:36.968 

2:09.290 

2:41.608 

D 

3:13.939 

1:04.647 

B 

H 

K 

I 

J 

L 

C 

0.000 

32.325 

1:04.647 

1:36.968 

2:09.290 

2:41.608 

0.000 

Profile length [nm] 

Profile length [nm] 

Profile length [nm] 

A

bs

ol

ut

e

 i

nt

ens

it

y

 

Intrabundle microtubule dynamics 

A

bs

ol

ut

e

 i

nt

ens

it

y

 

A

bs

ol

ut

e

 i

nt

ens

it

y

 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.