Microsoft Word 63770195-file00

18 

 

microtubule tips led to the development of fluorescence speckled microscopy with significant 

444 

implications for the in vivo elucidation of microtubule dynamics (e.g., Vallotton et al., 2003). 

445 

Among others, it provided a tool to discriminate treadmilling-based and motor-driven 

446 

microtubule translocation (Waterman-Storer and Salmon, 1997; Salmon and Waterman, 2011). 

447 

In  Arabidopsis thaliana hypocotyl cells labeled with GFP-TUA6 microtubule marker, cortical 

448 

microtubules were discontinuously labeled leading to their speckled appearance. Visual 

449 

inspection as well as quantitative fluorescence intensity profiling showed the alternation of bright 

450 

fluorescent islands and dark areas, separated at variable distances. Since such labeled 

451 

microtubules exhibited well resolved organization patterns and end-wise dynamics, it can be 

452 

assumed that the discontinuous microtubule labeling by GFP-TUA6 is owing to the stochastic 

453 

incorporation of GFP-TUA6-containing tubulin dimers and non-labeled dimers at the 

454 

microtubule ends.  

455 

Structure of cortical microtubule bundles and other subdiffraction details of the cortical 

456 

microtubule array 

457 

Microtubule bundle formation in interphase cortical arrays is mediated redundantly by members 

458 

of the MAP65 family including MAP65-1, MAP65-2 (e.g., Lucas and Shaw, 2012) and possibly 

459 

MAP65-5 (van Damme et al., 2004). Interestingly, MAP65-1 and MAP65-2 (along with the 

460 

cytokinesis specific MAP65-3) were previously identified as targets for MAPK phosphorylation 

461 

(Sasabe et al., 2011) which serves as a negative regulator of MAP65 affinity for the microtubule 

462 

surface (Smertenko et al., 2006). Importantly, MAP65-1 levels are significantly upregulated in 

463 

the mpk4 mutant while the levels of phosphorylated MAP65-1 are considerably lower compared 

464 

to the wild type (Beck et al., 2010). Theoretically, the above observations may explain the 

465 

mechanism behind extensive cortical microtubule bundling in the mpk4 mutant. 

466 

The arrangement of individual microtubules within microtubule bundles was visually and 

467 

quantitatively very clearly discriminated, suggesting that high performance SIM may be used for 

468 

mapping the associations of MAPs with microtubules and perhaps resolve intricate microtubular 

469 

super-structures such as the preprophase microtubule band. 

470 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

19 

 

Moreover, in comparison to WF and CLSM, SIM provided subdiffraction  details of cortical 

471 

microtubule organization not resolvable with the other techniques. With high performance SIM it 

472 

was possible to capture the onset of branched microtubule formation and release. The 

γ-tubulin-

473 

mediated branch initiation (Chan et al., 2009; Nakamura and Hashimoto, 2009; Nakamura et al., 

474 

2010) and the katanin-mediated branch release (Nakamura et al., 2010) are key mechanisms 

475 

supplementing the cortical array with nascent microtubules, thus SIM may provide a sub-

476 

diffraction tool that will allow the spatiotemporal resolution of this successive nucleation and 

477 

severing mechanism. 

478 

Subdiffraction microtubule dynamics 

479 

Time-lapsed imaging by SIM was traded for speed, thus the resolution of individual 

480 

microtubules was slightly inferior (135 and 133 nm for GFP-MBD and GFP-TUA6, 

481 

respectively) but still significantly outperformed all other imaging approaches (WF, CLSM, 

482 

TIRF and SD). Unfortunately, literature on dynamic plant cell studies is largely devoid of 

483 

resolution data. Thus there is no comparison measure other than the data included hereby. 

484 

However, the FWHM values for WF, CLSM, TIRF and SD are comparable to the resolutions 

485 

reported elsewhere (e.g., Zucker et al., 1999; Wang et al., 2005; Salmon and Waterman, 2011), 

486 

which optimally range within 250-270 nm. If this is also true for studies published previously in 

487 

plants then the difference between SIM and any other microscopic techniques is ca. 120 nm, 

488 

corresponding to roughly 195 tubulin subunits ([120 nm 

× 13 protofilaments]/8 nm tubulin dimer 

489 

size) in terms of microtubule length. 

490 

Microtubule dynamics at the faster plus end or the slower minus end evolve with the linear 

491 

addition or removal of tubulin dimers (Desai and Mitchison, 1997). Since the addition of tubulin 

492 

dimers during growth or the removal during shrinkage are roughly linear function of time the 

493 

respective rates are not expected to be influenced by the resolution of the microscopy platform 

494 

used. Indeed this was the case of SIM time-lapsed recordings of microtubule growth and 

495 

shrinkage rates, which were within previously published ranges for both molecular markers 

496 

(GFP-MBD; e.g. van Damme et al., 2004; Vos et al., 2004; and GFP-TUA6; e.g. Dhonukshe and 

497 

Gadella 2003; Shaw et al., 2003). Similarly the elongation and shrinkage rates measured for 

498 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---