Microsoft Word 63770195-file00

22 

 

other cytoskeletal proteins involved in various aspects of microtubule organization and dynamics 

557 

may be targeted and regulated by MAPK-dependent phosphorylation. 

558 

Concluding remarks and perspectives 

559 

Successful applications in live cell biology studies lag behind current advancements of 

560 

superresolution microscopy, owing to physical burdens imposed by the size and contour of plant 

561 

cells as well as by optical properties of cell walls. Herein one promising superresolution 

562 

technique, SIM, is quantitatively assessed and shows the potential to follow spatio-temporal 

563 

evolutions of cortical microtubules. 

564 

Present findings indicate the potential of SIM to unravel subdiffraction details of plant cortical 

565 

microtubule organization. Using SIM with high resolution optics and imaging setup, individual 

566 

microtubules were resolved well below Abbe’s limit. It was possible to describe the complexity 

567 

of microtubule bundle structure and characterize extra- and intrabundle microtubule dynamics 

568 

with length fluctuations below the limits of other techniques such as WF, CLSM, TIRF and SD. 

569 

Live SIM imaging will allow to shed new light on interactions of microtubules with MAPs that 

570 

induce bundling and bias the parallel arrangement of cortical arrays (Tulin et al., 2012, Stoppin-

571 

Mellet et al., 2013), but also to track microtubule nucleation processes in plant acentrosomal 

572 

cells (Binarová et al., 2006, Nakamura et al., 2010, Kirik et al., 2012, Stoppin-Mellet et al., 

573 

2013). Finally, the resolution of dynamic features of microtubule structures such as the 

574 

preprophase microtubule band (Müller et al., 2009), the mitotic spindle (Zhang &Dawe, 2011), 

575 

and the phragmoplast (Smertenko et al., 2011) could be the challenging task for future live SIM 

576 

imaging in the plant field. 

577 

578 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

23 

 

Materials and Methods 

579 

Plant material and sample preparation for microscopy 

580 

Seedlings of Arabidopsis thaliana ecotype Columbia (Col-0) carrying either GFP-MBD or GFP-

581 

TUA6 constructs as well as mpk4 mutant (in Col-0 background) carrying GFP-MBD construct 

582 

were used. Plants were stably transformed by the floral dipping method (Clough & Bent, 1998) 

583 

with either a cauliflower mosaic virus 35S promoter driven GFP fusion of the microtubule 

584 

binding domain of the mammalian microtubule associated protein MAP4 (proCaMV35S::GFP-

585 

MBD) (Marc et al., 1998), or with a similarly expressed fusion of GFP with the TUA6 alpha-

586 

tubulin isoform (proCaMV35S::GFP-TUA6) provided by Dr. Sidney Shaw. Seeds were surface 

587 

sterilized and placed on half-strength MS culture medium (pH 5.7) without vitamins containing 

588 

1% (w/v) sucrose and 0.4% (w/v) phytagel. The plates were stored at 4°C for 48 h to break 

589 

dormancy, and then kept vertically under 22°C in darkness for 5 days. Seedlings expressing 

590 

fusion constructs visualizing microtubules were transferred to microscopic slides that had been 

591 

modified into thin chambers using high precision and low thickness tolerance Nexterion round 

592 

cover slips (SCHOTT CR, a.s. Zašovská 850, 75701 Valašské Mezi

říčí, Czech Republic, HI, 

593 

D=0.17 mm ± 0.003 mm, diameter=25mm for objective "Plan-Apochromat" 100x/NA1.57 Oil, 

594 

DIC Corr, 000000-1787-996, very dense flint N-SSK2, refractive index n = 1.62229, Abbe 

595 

numbers Vd = 53.27, Ve = 52.99, reflectance at 0.5876 µm R = 0.05632). The chambers were 

596 

filled with the liquid half-strength MS medium either using one layer of parafilm as spacer or 

597 

without this spacer. Microchambers with seedlings were sealed with silicone paste to prevent 

598 

evaporation of liquid medium and stabilize samples during microscopy examinations.  

599 

Microscopy setup, optics and image acquisition 

600 

For WF, SIM, CLSM and TIRF all samples were examined in a Zeiss Axioimager Z.1 platform 

601 

equipped with the Elyra PS.1 super-resolution system for SR SIM and the LSM780 module for 

602 

CLSM using Zeiss objectives Alpha Plan Apochromat 63x/NA1.40 oil objective (tot. mag. 

603 

1008x and Alpha Plan Apochromat 100x/NA1.57 oil objective (tot. mag. 1600x) with 

604 

appropriate oils (Immersol 518F with refractive index of 1.518 for 63x/NA1.40 objective, and 

605 

Immersol HI with refractive index of 1.66 for 100x/NA1.57 objective). In few cases longer 

606 

imaging was done on a Zeiss LSM710 platform with a 63x/NA1.40 objective. Light source for 

607 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---