Microsoft Word 63770195-file00

13 

 

Intrabundle microtubule dynamics 

311 

Microtubule bundles are not static entities and individual microtubules exhibit vigorous dynamic 

312 

behavior within the crowded environment of a bundle similarly to individual microtubules (Shaw 

313 

& Lucas, 2011). 

314 

As shown previously, SIM offers superior contrast resolution, allowing the nearly linear titration 

315 

of bundled microtubule numbers by means of fluorescence intensity in the case of overlying 

316 

microtubules and by means of the Rayleigh criterion for laterally adjacent microtubules. Thus, it 

317 

was possible to follow and demonstrate intrabundle microtubule dynamics (Figs. 5A, I to K, L to 

318 

N) by kymographic analyses (Fig. 5J, M) showing that endwise growth and shrinkage rates are 

319 

comparable to those observed in free microtubules (Figs. 5P; Shaw & Lucas, 2011; Tables S3 

320 

and S4). Briefly, plus ends of intrabundle microtubules were growing and shrinking at 7.37

±3.27 

321 

μm/min (mean±SD; n=31; Fig. 5P; Tables S3 and S4) and 19.28±4.86 μm/min (mean±SD; n=33; 

322 

Fig. 5P; Tables S3 and S4) respectively. Accordingly the respective growth and shrinkage rates 

323 

of minus ends were 0.89

±0.83 

μm/min (mean±SD; n=37; Fig. 5P; Tables S3 and S4) and 

324 

1.05

±1.10 

μm/min (mean±SD; n=33; Fig. 5P; Tables S3 and S4). Similarly plus end growth and 

325 

shrinkage rates for GFP-TUA6-labeled intrabundle microtubules were 8.08

±3.98 (mean±SD; 

326 

n=31; Fig. 5P; Tables S3 and S4) and 21.41

±7.95 (mean±SD; n=35; Fig. 5P; Tables S3 and S4). 

327 

For the minus ends that were observed the respective values were 0.83

±1.53 (mean±SD; n=31; 

328 

Fig. 5P; Tables S3 and S4) and 0.89

±1.05 (mean±SD; n=31; Fig. 5P; Tables S3 and S4). 

329 

From the kymographs of intrabundle microtubule dynamics it appeared that at the temporal 

330 

range of observations (which was between 3 and 5 min for all the time-lapsed acquisitions) there 

331 

were more catastrophe/rescue transitions in intrabundle microtubules than those observed in 

332 

individual microtubules. In this case small length excursions, resulting from successive 

333 

rescue/catastrophe transitions, of ca. 200 nm visible by SIM (e.g., Figs. 5J, M, arrowheads) were 

334 

also considered and hence the overall catastrophe frequency of plus ends of intrabundle 

335 

microtubules was 0.032 events/s while the rescue frequency was 0.037 events/s (n=112 

336 

microtubules representing 321 minutes of observation). 

337 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

14 

 

When visible, in most cases minus ends exhibited very slow dynamics and few transitions (Fig. 

338 

5J). Exceptionally, very few short microtubules exhibited vigorous minus end dynamics with 

339 

alternating short length growth and shrinkage resembling dynamic instability (Fig. 5M).  

340 

Microtubule dynamics of the mpk4 mutant 

341 

The bulk of cortical microtubules of hypocotyl epidermal cells of the mpk4 mutant reside within 

342 

bundles therefore it was of interest to provide a preliminary characterization of extra- and 

343 

intrabundle microtubule dynamics for this mutant. 

344 

Thus the dynamic behavior of free (Figs. 6A to E) and bundled microtubules (Figs. 7A to L) was 

345 

characterized by SIM. Quantitative analysis based on kymographs (Figs. 6C, D) showed that free 

346 

microtubule ends of GFP-MBD-labeled cortical microtubules grow and shrink at variable rates, 

347 

while frequently the same microtubule was showing different growth and shrinkage rates during 

348 

successive events of rescue and catastrophe (Fig. 6D). This resulted in marginal lower rates of 

349 

growth compared to wild type at 4.14

±2.36 

μm/min (mean±SD; n=29; Fig. 6E; Tables S1 and 

350 

S2, by comparison to plus end dynamics of GFP-MBD-labeled microtubules from wild type 

351 

cells, p=0.0012) but more pronounced decline in shrinkage rates which were measured at 

352 

11.68

±5.63 

μm/min (mean±SD; n=34; Fig. 6E; Tables S1 and S2; by comparison to plus end 

353 

dynamics of GFP-MBD-labeled microtubules from wild type cells, p=0.00056). By contrast, the 

354 

minus end growth and shrinkage rates were not significantly affected with elongation rated at 

355 

0.75

±0.75 

μm/min (mean±SD; n=36; Fig. 6E; Tables S1 and S2; by comparison to plus end 

356 

dynamics of GFP-MBD-labeled microtubules from wild type cells, p=0.22) and shrinkage at 

357 

0.81

±0.83 

μm/min (mean±SD; n=32; Fig. 6E; Tables S1 and S2; by comparison to plus end 

358 

dynamics of GFP-MBD-labeled microtubules from wild type cells, p=0.50). 

359 

Notably, the small length excursions which were reported for free ends of GFP-MBD-labeled 

360 

cortical microtubules from wild type cells as well as the overall growth/shrinkage transitions 

361 

appeared to be less frequent in the mpk4 mutant. Therefore overall catastrophe and rescue 

362 

frequencies were quantified and their respective values were 0.016 events/s (catastrophe 

363 

frequency; n=30 microtubules representing 82 minutes of observation) and 0.016 events/s 

364 

(rescue frequency; n=30 microtubules representing 82 minutes of observation). 

365 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---