Microsoft Word 63770195-file00

7 

 

S1B) and CLSM (Fig 1A; bottom inset and Fig. S1C). Visualization of GFP-TUA6 labeled 

139 

microtubules is inherently compromised by background possibly owing to free tubulin dimers 

140 

containing GFP-TUA6. With SIM however such problems were significantly ameliorated and 

141 

GFP-TUA6 cortical microtubules were visualized with high contrast (Fig. 1B and Fig. S1D). 

142 

Furthermore, it was shown by SIM that GFP-TUA6 is incorporated to the microtubule lattice in a 

143 

discontinuous manner (Fig. 1B; top inset; Fig. S1D) which was not apparent in WF (Fig. 1B; 

144 

bottom inset; Fig. S1E). Such discontinuous incorporation of GFP-TUA6 tagged dimers in the 

145 

microtubule lattice (for mechanism see Waterman-Storer and Salmon, 1998) was best 

146 

appreciated with linear profiles drawn along GFP-TUA6 labeled microtubules. These showed 

147 

alternating, bell-shaped fluorescence intensities of variable amplitude, with clear peak-to-peak 

148 

separation by SIM (Fig. S2A inset and Fig. S2C) as compared to WF (Fig. S2B inset and Fig. 

149 

S2C). The read-out of such profiles (Fig. S2C) also showed that maximum fluorescence 

150 

intensities with SIM are well above background levels when compared to WF, further 

151 

substantiating the use of SIM in generating highly contrasted acquisitions in samples inherently 

152 

plagued with high background fluorescence as the GFP-TUA6 expressing hypocotyl cells. The 

153 

speckled appearance of GFP-TUA6-labeled microtubules probably reflects to the stochastic 

154 

incorporation of GFP-TUA6-containing dimers diluted in a soluble tubulin pool of unlabeled 

155 

dimers and it might prove a useful source for fluorescence speckled microscopy (Salmon & 

156 

Waterman, 2011). 

157 

Microtubule nucleation through lateral branching from walls of pre-existing microtubules, was 

158 

also followed by SIM, as it represents a major mechanism of microtubule nucleation in higher 

159 

plants (Chan et al., 2009). SIM allowed visualizing the very onset of branch formation and 

160 

release of nascent microtubules (Fig. 1C; top inset and Fig. S1F) while this was not possible with 

161 

WF (Fig. 1C; bottom inset and Fig. S1G). 

162 

In addition, SIM resolved in good detail the composite nature of cortical microtubule bundles, 

163 

especially in the mpk4 mutant (Fig. 1D; top inset and Fig. S1H), and outperformed WF (Fig. 1D; 

164 

middle inset and Fig. S1I) and CLSM (Fig. 1D; bottom inset and Fig. S1J) in this respect. The 

165 

discrimination of very proximal microtubules was best illustrated in orthogonal projections, 

166 

which provided a clear view on the resolution potential of SIM (Fig. 1E) as compared to WF 

167 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---

8 

 

(Fig. 1F) and CLSM (Fig. 1G) making possible to clearly discriminate such adjacent 

168 

microtubules as individual fluorescent spots with SIM (Fig. 1E) compared to WF (Fig. 1F) and 

169 

CLSM (Fig. 1G) which showed only one area of diffuse fluorescence.  

170 

The quantitative potential of SIM superresolution capacities was measured with the full width at 

171 

half maximum (FWHM) of normalized, fluorescence intensity profiles drawn perpendicular to 

172 

individual microtubules. Averaged FWHM values of GFP-MBD and GFP-TUA6 were then 

173 

compared to respective values obtained with WF and CLSM. During profiling of individual 

174 

microtubules, care was taken to use identical and co-aligned profiles, meaning that the maximum 

175 

intensity of all profiles was located at the same position (see Materials and Methods). Since the 

176 

software used (see Materials and Methods) gives different values for SIM, WF and CLSM, all 

177 

intensity profiles were normalized to values between 0-1. From the bell curves obtained in this 

178 

way, the FWHM corresponds to the width of the curve at a normalized intensity value of 0.5. 

179 

Taking into account the above, SIM outperformed WF and CLSM resolution. The FWHM for 

180 

GFP-MBD microtubules was 106±20 nm (mean

±SD; n=27; Fig. 1H) while for GFP-TUA6 

181 

microtubules it was 118±25 nm (mean

±SD; n=42; Fig. 1I). The difference between the mean 

182 

FWHM for GFP-MBD labeled microtubules and for GFP-TUA6-labaled microtubules is not 

183 

significant (p=0.141). The respective FWHM value for GFP-MBD microtubules visualized by 

184 

WF was 231±26 nm (mean

±SD; n=27; Fig. 1H) and for CLSM it was 235±20 nm (mean±SD; 

185 

n=27; Fig. 1J), while TUA6-GFP labeled microtubules were resolved at 223±44 nm (mean

±SD; 

186 

n=42; Fig. 1I) by WF and at 325±42 nm (mean

±SD; n=47; Fig. 1K) by CLSM. 

187 

For some acquisitions a 63

×1.40NA oil immersion objective was used to acquire SIM (Fig. 1C, 

188 

Fig. S3A, S3B) since similar objectives with similar numerical apertures are routinely used for in 

189 

vivo time-lapsed imaging of plant cells (e.g., Shaw et al., 2003 and van Damme et al., 2004 using 

190 

63

×1.20NA objectives; Vos et al., 2004 using 63×1.40NA). Although this objective allowed 

191 

subdiffraction acquisitions with SIM (with an average FWHM of 146

±24 nm (mean±SD; n=24; 

192 

Fig. S3B, S3C) this value was inferior to the 100

×1.57NA oil immersion objective which was 

193 

used exclusively thereon. 

194 

Quantitative analysis of cortical microtubule bundles 

195 

 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

---