Microsoft Word 63770195-file00



Yüklə 1,51 Mb.
Pdf görüntüsü
səhifə7/16
tarix22.07.2018
ölçüsü1,51 Mb.
#57667
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   ...   16

15 

 

Intrabundle dynamics were also addressed in the mpk4 mutant (Figs. 7A to L; Video S3) and in 



366 

this case growth and shrinkage rates as well as catastrophe and rescue frequencies were found 

367 

similarly reduced. Thus, based on kymographs (Figs. 7E to G) intrabundle microtubule plus ends 



368 

were growing at 4.45

±3.27 

μm/min (mean±SD; n=22; Fig. 7L; Tables S3 and S4; by comparison 



369 

to plus end dynamics of GFP-MBD-labeled microtubules from wild type cells, p=0.0053) and 

370 

shrinking at 5.81



±5.20 

μm/min (mean±SD; n=32; Fig. 7L; Tables S3 and S4; by comparison to 

371 

plus end dynamics of GFP-MBD-labeled microtubules from wild type cells, p<0.0001). The 



372 

respective rates for discernible minus ends were 0.47

±0.63 

μm/min (mean±SD; n=37; Fig. 7L; 



373 

Tables S3 and S4; by comparison to plus end dynamics of GFP-MBD-labeled microtubules from 

374 

wild type cells, p<0.023) and 0.69



±0.88 

μm/min (mean±SD; n=32; Fig. 7L; Tables S3 and S4; 

375 

by comparison to plus end dynamics of GFP-MBD-labeled microtubules from wild type cells, 



376 

p=0.11). The catastrophe and rescue frequencies were 0.015 events/s and 0.020 events/s (n=89 

377 

representing 285 minutes of observation). 



378 

Side observations on microtubule organization in the mpk4  mutant showed the formation of 

379 

short, rigid and non-growing microtubule bundles (e.g., Fig. 8A, B, E) consisting of 3-4 



380 

microtubules as judged by their maximum fluorescence intensity (Fig. 8F). These were often 

381 

positioned free in the cytoplasm but frequently formed tip-wise attachments with the walls of 



382 

microtubules or microtubule bundles (Fig. 8E). When attached these bundles were either gliding 

383 

over short distances (e.g., Fig. 8B to D) or swinging around the attachment point (Fig. 8B).  



384 

 

385 


386 

 

www.plantphysiol.org



on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.



16 

 

Discussion 

387 

General remarks 

388 


The temporal resolution of intracellular dynamics always progressed together with advances in 

389 


microscopy (e.g., Waterman-Storer, 1998). In this respect superresolution techniques that were 

390 


developed and vigorously upgraded during the past two decades (Hensel et al., 2013) are slowly 

391 


implemented to biological studies of dynamic subcellular events (e.g., Rego et al., 2012). To date 

392 


platforms of patterned illumination (e.g., STED and SIM; Hell, 2007, Allen et al., 2014) or 

393 


precision of localization (e.g., PALM and STORM; Small and Parthasarathy, 2014) 

394 


superresolution microscopies are commercially available, making superresolution imaging 

395 


widely accessible. 

396 


Knowledge on microtubule dynamics and organization, and their regulation by various MAPs, 

397 


was largely advanced by in vitro imaging of purified components (e.g., Dogterom and Surrey, 

398 


2013). In such assays fluorescently labelled or unlabeled microtubules grow in observation 

399 


chambers, nearly attached to the coverslip and hence they can be very clearly recorded at video 

400 


rates. However, the in vitro acquisition of microtubule dynamics is very frequently conflicting 

401 


with more physiological in vivo studies (Li et al., 2012; Zanic et al., 2013).  

402 


In plants a fine example of such discrepancy can be found in the elucidation of the dynamics of 

403 


in vitro assembled and MAP-free carrot tubulin by AVEC-DIC (Moore et al., 1997). Thereby a 

404 


stunning shortening velocity of 195 

μm/min was reported being nearly 10 times higher than the 

405 

respective rates recorded in vivo on microtubules labeled with various markers such as 



406 

microinjected fluorophore-conjugated brain tubulin, GFP-MBD, GFP-TUA6, GFP-MAP65-1 or 

407 

GFP-EB1a (e.g., Zhang et al., 1990; Dhonukshe and Gadella, 2003; Shaw et al., 2003; van 



408 

Damme et al., 2004; Vos et al., 2004).  

409 

Subdiffraction microtubule organization 

410 


Considering the above, SIM was applied to study the organization of cortical microtubule arrays 

411 


in hypocotyl epidermal cells of Arabidopsis thaliana stably transformed with GFP-MBD and 

412 


GFP-TUA6 markers. Due to the propensity of plant cortical microtubule arrays to form extensive 

413 


bundles (e.g., Wasteneys and Ambrose, 2009), SIM observations were extended to hypocotyl 

414 


 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.



17 

 

epidermal cells of the mpk4 mutant where microtubule bundle formation is more pronounced 



415 

(Beck et al., 2010). 

416 

The point spread function of individual microtubules was determined experimentally for both 



417 

GFP-MBD and GFP-TUA6 labeled microtubules by means of normalized fluorescence intensity 

418 

profiling and determination of the FWHM for transverse profiles of such microtubules. As 



419 

expected from the specifications of the SIM platform used (see Materials and Methods) and the 

420 

theory behind superresolution imaging with SIM (Gustaffsson, 2000), resolution after high 



421 

performance imaging (see Materials and Methods for details) was nearly twice as good as the 

422 

ideal diffraction-limited resolution which cannot exceed 200 nm (Abbe’s limit; e.g., 



423 

Verdaasdonk et al., 2014), and it reached 106 nm for GFP-MBD labeled microtubules and 117 

424 

nm for GFP-TUA6 labeled microtubules. These values are very close to the theoretical 100 nm 



425 

resolution predicted for linear SIM (Gustaffsson, 2000, Verdaasdonk et al., 2014). In the same 

426 

manner, high quality acquisitions with WF and CLSM were considerably above Abbe’s limit 



427 

(roughly between 225 and 325 nm) but nevertheless within the limits reported for such 

428 

microscopies (e.g., Zucker and Price, 1999; Salmon and Waterman, 2011). 



429 

SIM imaging revealed discontinuous incorporation of GFP-TUA6 fusion proteins to the 

430 

microtubule lattice, leading to the speckled appearance of such labeled microtubules. As 



431 

previously reported GFP-TUA6 is indistinguishably assembly-competent with unlabeled tubulin 

432 

dimers incorporating the native TUA6 (Shaw et al., 2003) or other 



α-tubulin isoforms expressed 

433 


in hypocotyl cells. Based on the normal phenotypes of GFP-TUA6 transformed seedlings and the 

434 


similar growth/shrinkage rates of GFP-TUA6-labeled microtubules or microtubules labeled by 

435 


microinjection of Tradescantia stamen hair cells with fluorophore-conjugated brain tubulin 

436 


(Zhang et al., 1990), it was concluded that the GFP-TUA6 marker is not affecting microtubule 

437 


dynamics and function (see Shaw et al., 2003).   

438 


The speckled decoration of intracellular filamentous polymeric structures such as actin filaments 

439 


or microtubules was first reported when such structures were allowed to assemble in the presence 

440 


of very low levels (e.g. 0.01%-0.25% of labeled molecules with respect to the total pool) of 

441 


fluorescently labeled monomers diluted in a pool of unmodified monomers (e.g. Salmon and 

442 


Waterman, 2011). The stochastic incorporation of either labeled or unlabeled tubulin dimers in 

443 


 

www.plantphysiol.org

on July 21, 2018 - Published by 

Downloaded from 

Copyright © 2014 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.



Yüklə 1,51 Mb.

Dostları ilə paylaş:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   ...   16




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©genderi.org 2024
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə