[66]
shveytsariyalik olim Ulrix Laemmli denaturatsiya asosida oqsillarni elektroforez
bilan ajratish usulini taklif qildi.
Birinchidan, oqsillar molekulyar massasiga ko‗ra,
qatlamlar shaklida natriy dodesil sulfating.
Natriy dodesil sulfat, SDS
ta‘sirida
denaturatsiyaga uchratilgan. Oqsil qancha ko‗p bo‗lsa, SDS shuncha ko‗p
bog‘lanadi va ularning kompleksi shunchalik salbiy zaryadga ega bo‗ladi. Shuning
uchun, namunalar poliakrilamid gelida tekshirilganda, ular elektr maydon ta‘sirida
harakatlana
boshlaydilar, oqsil molekulalarining harakatlanish tezligi ularning
massasiga bog‘liq, yengil oqsillar gel bo‗ylab tezroq harakatlanadi. Ushbu uslubda
molekulyar massasi 5 dan 250 kDa gacha bo‗lgan oqsillarni ajratish uchun juda mos
keladi. Laemmli usuli yanada rivojlantirildi, 1975 yilda Patrik O‗Farell va Yoaxim
Kloz mustaqil ravishda ikki o‗lchamli elektroforez usulini taklif qilishdi. SDS
yordamida ajratishdan oldin oqsillarni izoelektrik nuqtalariga ko‗ra oldindan
ajratiladi. Birinchidan, oqsillar statsionar pH ko‗rsatkichiga ko‗ra, maxsus
polimerlar bilan to‗ldirilgan shisha naychaga kiritiladi. Oqsillar naycha orqali
taqsimlanadi, pH korsatkichga ko‗ra, oqsillar izoelektrik nuqtasiga teng bo‗lgan
maydonlarga joylashadi. Keyinchalik, naychaning tarkibi ajratiladi va an‘anaviy
Laemmli boyicha gelda elektroforez o‗tkaziladi. Shunday qilib,
oqsillar avval
izoelektrik nuqtaga, so‗ngra molekulyar massasiga ko‗ra bo‗linadi. Ikki o‗lchamli
elektroforez usulida oqsillar an‘anaviy elektroforezdagi kabi tasma bilan emas, balki
oqsil kontsentratsiyasiga to‗g‘ri keladigan bo‗yalish intensivligi orqali aniqlanadi.
Ikki o‗lchamli elektroforez yordamida nafaqat turli xil oqsillarni, balki bir xil
oqsilning izoformalarini , shuningdek, translyatsiyadan keyingi modifikatsiyalari har
xil bo‗lgan oqsil shakllarini ajratish mumkin. Ikki o‗lchamli elektroforez texnikasini
turli xil takomillashtirish taklif qilindi, uning ba‘zi bosqichlari,
shuningdek gell
skanerlarni qayta ishlash tizimlari avtomatlashtirildi. Aslida, ikki o‗lchamli
elektroforez – bu proteomni tasavvur qilishning yagona usuli hisoblanadi.
[67]
Western blotting uslubi.
Ba‘zi hollarda organizmlardan izolyatsiya qilingan
hujayra oqsillarini ma‘lum hujayra antitanalar
bilan o‗zaro ta‘sir qilishini aniqlash uchun
Western blotting usuli qo‗llaniladi. Western
blot yoki immunoblot uslubi oqsillarni
antitanalar orqali aniqlashga asoslangan.
Reaksiya birinchi
bosqichida poliakrilamid
gelida denaturasiyaga uchragan oqsillar
uzunligi bo‗yicha yoki oqsil nativ holati
uchlamchi strukturasiga ko‗ra, SDS tasirida
elektroforez o‗tkaziladi. Keyinchalik oqsillar
natriysellyulozaali
yo‗ki
PVDF-
membranalarga o‗tkaziladi
va oqsillarga
nisbatan maxsus bo‗lgan monoklonal yo‗ki
poliklonal antitanalar yordamida deteksiya
qilinadi
(25-rasm).
Western
blotting
molekulyar biologiya, biokimyo, genetika va
boshqa sohalarga keng qo‗llaniladi.
Xuddi
shunga o‗xshash, immunoenzim- ELISA yoki
immunobo‗yash uslublari ham oqsillarni
maxsus antitanalar yordamida aniqlashda
ishlatiladi. Western blotting uslubi George
Stark
tomonidan
Stenford
Univeriteti
laboratoriyasida ishlab chiqilgan bo‗lib, western blot nomlanishi W.Neal Burnett
tomonidan berilgan. Uslub nomlanishi southern-blotting
DNK ni aniqlash
texnologiyasini aniqlagan Edvin Southern nomiga atalgan va western-blotting uslubi
shunga asosan nomlangan. Huddi shuningdek, analogiyada RNK ni aniqlash uslubi
Northering- blotting deb ataladi va oqsillar modifikasiyasining post translyasion
deteksiyasi uslubi Eastern blotting deb nomlanadi (29-rasm).
A)Ikki o‘lchamli elektroforez
B)
SDS
tomonidan
oqsillarni
denaturasiyasi
C)
2D
elektroforez
asosida
oqsillarni bo‘yash intensivligi
Dostları ilə paylaş: