O„zbekiston respublikasi oliy va o„rta maxsus ta‟lim vazirligi samarqand davlat universiteti
Yüklə 4,93 Mb. Pdf görüntüsü
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- 28-rasm. Edman uslubida oqsilning feniltiogidantoin N-uchini aniqlash
| Ikki o„lchamli gel elektroforez.
1970-80 yillarda oqsillarni ajratish va tozalash usullari rivojlandi. Ushbu usullar xromatografiya va elektroforez uslublarining prinsiplarini birlashtirdi, ularning ko‗plari uzoq vaqtdan beri ishlatilmay qolgan, ammo ba‘zilari hali 21-asrda ishlatilmoqda. 1970 yilda 28-rasm. Edman uslubida oqsilning feniltiogidantoin N-uchini aniqlash [66] shveytsariyalik olim Ulrix Laemmli denaturatsiya asosida oqsillarni elektroforez bilan ajratish usulini taklif qildi. Birinchidan, oqsillar molekulyar massasiga ko‗ra, qatlamlar shaklida natriy dodesil sulfating. Natriy dodesil sulfat, SDS ta‘sirida denaturatsiyaga uchratilgan. Oqsil qancha ko‗p bo‗lsa, SDS shuncha ko‗p bog‘lanadi va ularning kompleksi shunchalik salbiy zaryadga ega bo‗ladi. Shuning uchun, namunalar poliakrilamid gelida tekshirilganda, ular elektr maydon ta‘sirida harakatlana boshlaydilar, oqsil molekulalarining harakatlanish tezligi ularning massasiga bog‘liq, yengil oqsillar gel bo‗ylab tezroq harakatlanadi. Ushbu uslubda molekulyar massasi 5 dan 250 kDa gacha bo‗lgan oqsillarni ajratish uchun juda mos keladi. Laemmli usuli yanada rivojlantirildi, 1975 yilda Patrik O‗Farell va Yoaxim Kloz mustaqil ravishda ikki o‗lchamli elektroforez usulini taklif qilishdi. SDS yordamida ajratishdan oldin oqsillarni izoelektrik nuqtalariga ko‗ra oldindan ajratiladi. Birinchidan, oqsillar statsionar pH ko‗rsatkichiga ko‗ra, maxsus polimerlar bilan to‗ldirilgan shisha naychaga kiritiladi. Oqsillar naycha orqali taqsimlanadi, pH korsatkichga ko‗ra, oqsillar izoelektrik nuqtasiga teng bo‗lgan maydonlarga joylashadi. Keyinchalik, naychaning tarkibi ajratiladi va an‘anaviy Laemmli boyicha gelda elektroforez o‗tkaziladi. Shunday qilib, oqsillar avval izoelektrik nuqtaga, so‗ngra molekulyar massasiga ko‗ra bo‗linadi. Ikki o‗lchamli elektroforez usulida oqsillar an‘anaviy elektroforezdagi kabi tasma bilan emas, balki oqsil kontsentratsiyasiga to‗g‘ri keladigan bo‗yalish intensivligi orqali aniqlanadi. Ikki o‗lchamli elektroforez yordamida nafaqat turli xil oqsillarni, balki bir xil oqsilning izoformalarini , shuningdek, translyatsiyadan keyingi modifikatsiyalari har xil bo‗lgan oqsil shakllarini ajratish mumkin. Ikki o‗lchamli elektroforez texnikasini turli xil takomillashtirish taklif qilindi, uning ba‘zi bosqichlari, shuningdek gell skanerlarni qayta ishlash tizimlari avtomatlashtirildi. Aslida, ikki o‗lchamli elektroforez – bu proteomni tasavvur qilishning yagona usuli hisoblanadi. [67] Western blotting uslubi. Ba‘zi hollarda organizmlardan izolyatsiya qilingan hujayra oqsillarini ma‘lum hujayra antitanalar bilan o‗zaro ta‘sir qilishini aniqlash uchun Western blotting usuli qo‗llaniladi. Western blot yoki immunoblot uslubi oqsillarni antitanalar orqali aniqlashga asoslangan. Reaksiya birinchi bosqichida poliakrilamid gelida denaturasiyaga uchragan oqsillar uzunligi bo‗yicha yoki oqsil nativ holati uchlamchi strukturasiga ko‗ra, SDS tasirida elektroforez o‗tkaziladi. Keyinchalik oqsillar natriysellyulozaali yo‗ki PVDF- membranalarga o‗tkaziladi va oqsillarga nisbatan maxsus bo‗lgan monoklonal yo‗ki poliklonal antitanalar yordamida deteksiya qilinadi (25-rasm). Western blotting molekulyar biologiya, biokimyo, genetika va boshqa sohalarga keng qo‗llaniladi. Xuddi shunga o‗xshash, immunoenzim- ELISA yoki immunobo‗yash uslublari ham oqsillarni maxsus antitanalar yordamida aniqlashda ishlatiladi. Western blotting uslubi George Stark tomonidan Stenford Univeriteti laboratoriyasida ishlab chiqilgan bo‗lib, western blot nomlanishi W.Neal Burnett tomonidan berilgan. Uslub nomlanishi southern-blotting DNK ni aniqlash texnologiyasini aniqlagan Edvin Southern nomiga atalgan va western-blotting uslubi shunga asosan nomlangan. Huddi shuningdek, analogiyada RNK ni aniqlash uslubi Northering- blotting deb ataladi va oqsillar modifikasiyasining post translyasion deteksiyasi uslubi Eastern blotting deb nomlanadi (29-rasm). A)Ikki o‘lchamli elektroforez B) SDS tomonidan oqsillarni denaturasiyasi C) 2D elektroforez asosida oqsillarni bo‘yash intensivligi Yüklə 4,93 Mb. Dostları ilə paylaş:
|