Quraqlıq Stresi Zamanı Amarant Yarpaqlarının Sitozol və Mitoxondri Fraksiyalarında nad-malatdehidrogenaza Fermentinin Müqayisəli



Yüklə 133,09 Kb.

tarix21.10.2017
ölçüsü133,09 Kb.


AMEA-nın Xəbərləri (biologiya və tibb elmləri), cild 70, №3, səh. 39-47 (2015)

 

39 



Quraqlıq Stresi Zamanı Amarant Yarpaqlarının Sitozol və Mitoxondri 

Fraksiyalarında NAD-Malatdehidrogenaza Fermentinin Müqayisəli 

Öyrənilməsi 

 

H.Q. Babayev 

 

AMEA Molekulyar Biologiya və Biotexnologiya İnstitutu, Mətbuat prospekti, 2A, Bakı AZ 1073, Azərbaycan; 

E-mail: babayev_hg@yahoo.co.uk 

 

Amarant yarpaqlarının mezofil (MH) və örtük topa hüceyrələrinin (ÖTH) sitozol və mitoxondri 

fraksiyalarında bitkinin inkişafının çiçəkləmə (Ç) və toxum yetişmə (TY) fazalarında quraqlığın 

təsirindən NAD-malatdehidrogenaza (l-malate-NAD-oksidoreduktaza, NAD-MDH, EC 1.1.1.37) 

fermentinin lokalizasiyası, izoferment spektri, fiziki-kimyəvi və kinetik xassələri tədqiq olunmuşdur. 

Müəyyən olunmuşdur ki, amarant yarpaqlarında bitkinin inkişaf fazasından asılı olaraq NAD-MDH 

geniş izoferment spektrinə malikdir və quraqlığın təsirindən fermentin izoformalarının sayında, 

fəallığında və  xassələrində  əhəmiyyətli dəyişkənliklər baş verir. MDH-nin sitozol NAD-MDH-nın 

(sNAD-MDH) kataliz etdiyi reaksiyanın V

max

OA qiyməti mitoxondri NAD-MDH-sına (mNAD-MDH) 

nisbətən 2 dəfə çoxdur. Fermentin bütün izoformaları geniş pH optimuma malikdirlər və temperatura 

qarşı davamlılıq göstərirlər. Ferment subhüceyrə fraksiyasından asılı olaraq öz substratı olan 

oksalasetata (OA) qarşı yüksək, malata qarşı isə  aşağı  həssaslığa malikdir. NAD-MDH-nın kataliz 

etdiyi reaksiya, ümumilikdə, Mixaelis-Menten qanunauyğunluğuna tabe olub, heç bir allosteriklik 

göstərmir. Fermentin aktivliyi aralıq substratlar, bir və iki valentli ionlarla ciddi tənzim olunur.  

 

Açar sözlər:  Amarant, mezofil hüceyrələri, örtük topa hüceyrələri, NAD-malatdehidrogenaza, izoforma, 



lokalizasiya, quraqlıq, adaptasiya 

 

 

GİRİŞ 

 

Quraqlıq stresinin təsirindən bitkilərdə suyun 



nisbi miqdarı, su potensialı, hüceyrənin turqor təz-

yiqi aşağı düşür, qeyri-üzvü ionların və  həll olan 

maddələrin miqdarı artır, məhsuldarlıq isə azalır 

(Fedoroff et al., 2010). Quraqlıq stresi nəticəsində 

bitkinin inkişafının ləngiməsinin,başqa səbəblərlə 

yanaşı, qismən karbon statusundakı  dəyişikliklərlə 

bağlı olması ilə yanaşı, həm də fotosintetik assimil-

yatların müxtəlif orqanlar arasında paylanmasından, 

həmçinin fotosintez və tənəffüs arasındakı tarazlıq-

dan da asılıdır (Flexas et al., 2006). Bəzi tədqiqat-

çılar göstərirlər ki, stres amillərinin təsirindən foto-

sintezin inhibirləşməsinin səbəblərindən biri də 

CO

2

-nin fiksasiyasının ferment sistemləri ilə elek-



tronların qeyri-tsiklik daşınması arasındakı funksio-

nal  əlaqənin pozulmasıdır (Murata et al., 2007). 

Aparılan tədqiqatlar zamanı müəyyən olunmuşdur 

ki, orqanizmlərin mühitin dəyişən  şəraitinə cavab 

reaksiyası hüceyrənin konstruktiv və energetik mü-

badiləsində mühüm rol oynayan malatdehidrogena-

za (MDH) sistemi fermentlərinin labilliyi ilə  də 

bağlı ola bilər(Сатар и др., 2010). 

Bitki MDH sistemi fermentləri özünü orqa-

nizmlərin tələbatına və fizioloji vəziyyətinə, həmçi-

nin ətraf mühitin dəyişməsinə cavab vermək imkan-

larına malik olan zülalların dinamik tarazlığı kimi 

təqdim edir (Пинейру де Карвалью и др., 1991).  

Bitki toxumaları malatla OA-ın qarşılıqlı çev-

rilməsini kataliz edən NAD-MDH-nın çoxsaylı izo-

formalarına malikdirlər (Пинейру  де  Карвалью  и 

др., 1991). Bitkilərdə müxtəlif genlərlə kodlaşan bu 

izoformalar fərqli kinetik xassələrə, subhüceyrə 

paylanmasına və fizioloji funksiyalara malikdirlər 

(Gietl, 1992). 

МDH fermentlərinə arxeobakteriyalardan tut-

muş  məməlilərə  qədər bütün canlı orqanizimlərdə 

və bütün subhüceyrə orqanoidlərində (mitoxondri-

lərdə, qlioksisomlarda, peroksisomlarda, хloroplast-

larda və s.) rast gəlmək olur (Selinski et al., 2014). 

Bütün MDH-lar iki və ya dörd identik sub-

vahidlərdən ibarət multimer fermentlərdir (Yash-

vant et al., 2013). mNAD-MDH-nın bitkilərdə bir 

neçə istiqamətdə  fəaliyyət göstərdiyi güman edilir. 

O, klassik Krebs tsiklinın son reaksiyasının məh-

sulu olan malatı OA-a qədər oksidləşdirir (Nunes-

Nesi et al., 2007). mNAD-MDH yalnız Krebs döv-

ranında NADH-ın oksidləşməsi üçün deyil, həm-

çinin müxtəlif hüceyrə kompartmentlərindəki meta-

bolik yollar arasında reduksiyaedici ekvivalentlərin 

mübadiləsində də iştirak edir (Tomaz et al., 2010). 

Bəzi müəlliflər MDH subvahidlərinin yalnız tə-

nəffüs ilə deyil (Tomaz et al., 2010), fototənəffüs, 

yağ turşularının β-oksidləşməsi, toxumun cücərmə-

si və stresə davamlılıq kimi proseslərlə  də  əlaqəli 

olduğunu göstərirlər (Wang et al., 2014).  



Quraqlıq Stresi Zamanı Amarant Yarpaqlarının 

40 


Beləliklə, NAD-MDH-nın mühüm bir funksi-

yanı yerinə yetirməsi onun ali bitkilərdə karbonun 

və enerjinin paylanmasında vacibliyini göstərir və 

tənəffüs, fotosintez və fototənəffüsü  əlaqələndirən 

molekulyar mexanizmlər haqqında yeni ideyalar 

verir (Tomaz et al. 2010). 

C

4

-bitkilərdə yarpaqların mürəkkəb anatomik 



və morfo-fizioloji quruluşa malik olması onlara C

3

-



bitkilərlə müqayisədə daha çox adaptiv xassə verir 

(Бальнокин и др., 2005). Stres vəziyyətinə düşmüş 

bitkilərdə stresə qarşı adaptasiyanın yaranmasının 

biokimyəvi və molekulyar mexanizmlərinin öyrə-

nilməsi hələlik tam olaraq öz həllini tapmamışdır. 

Burada maraqlı amillərdən biri də MDH sistemi 

fermentlərinin labilliyi, mürəkkəb izoenzim spektri-

nə malik olması və polifunksionallığıdır.  

Bütün bunları nəzərə alaraq apardığımız tədqi-

qatların  əsas məqsədi-quraqlığın təsirindən NAD-

malik enzim tip C

4

-bitki olan amarant yarpaqlarının 



MH və ÖTH-ninsitozol fraksiyasında NAD-MDH-

nınaktivliyinin, izoenzim spektrinin, lokalizasiya-

sının, bəzi fiziki-kimyəvi və kinetik xassələrinin 

öyrənilməsindən ibarətdir.  

 

 

MATERİAL VƏ METODLAR 

 

Tədqiqat obyekti olaraqtəbii  şəraitdə becəril-

miş NAD-malik enzim tip C

4

-bitkisi olan amarantın 



Amaranthus cruentus L. növü götürülmüşdür. İnki-

şafın 30-cu günündən başlayaraq quraqlıq varian-

tında suvarılma dayandırılaraq süni torpaq quraqlığı 

yaradılmış, kontrol bitkilərdə isə suvarılma vegeta-

siyanın sonunadək davam etdirilmişdir. Amarant 

yarpaqlarınin assimilyasiyaedici toxumalarının ay-

rılması bizim tərəfimizdən modifikasiya olunmuş 

üsulla həyata keçirilmişdir(Guliyev et al., 2003).  



Ferment preparatının alınması: Ferment 

preparatı almaq üçün yarpaqlar gövdədən ayrılmış, 

distillə suyu ilə yuyulduqdan, filtr kağızı ilə quru-

dulduqdan sonra qayçı ilə xırda hissələrə doğranmış 

və  həvəngdə kvars qumunun iştirakı ilə 2 dəqiqə 

müddətində 20 мМ MgCl

2

·6H


2

O, 1 мМ  ЕДТА, 5 

мМ ДТТ və 0,5% PVP-25 tərkibli, 100 mМ,pH 8,0 

Тris-HCl bufer məhlulunda +4ºC temperaturda ho-

mogenizasiya olunmuşdur (1:5, M/V). Subhüceyrə 

fraksiyalarının və membran zülallarının ayrılması 

üçün homogenizasiya buferinə 1%-li Triton X-100 

əlavə olunmuşdur. Alınan homogenat ikiqat kap-

rondan süzüldükdən sonra nüvədən və parçalanma-

yan toxuma qalıqlarından azad olmaq üçün əvvəlcə 

5 dəq 1000 g, sonra isə 15 dəq 10000 g sürəti ilə 

sentrifuqalaşdırılmışdır. Çöküntü atıldıqdan sonra 

supernatant fermentin aktivliyini təyin etmək üçün 

istifadə edilmişdir. 



NAD-MDH aktivliyinin təyini:  NAD-MDH 

aktivliyi spektrofotometrik (Ultrospec 3300 pro, 

Amersham, USA) üsulla təyin olunmuşdur (Schei-

be, Stitt, 1988). OA-nın reduksiyasının reaksiya 

mühiti 1 mM OA, 10 mg/ml BSA, 10 mM 

MgCl


2

·6H


2

O, 0,15 мМ NAD·H və 5-10 µl ferment 

preparatı olan 100 мМ, pH 8,0, Tris-HCl 

buferindən ibarətdir. Reaksiya mühitinə 1 mM OA 

əlavə olunmaqla reaksiyanın başlanmasına start ve-

rilmişdir. Birbaşa reaksiyanın mühiti tərkibində 30 

mM malat, 0,2 mM NAD olan 100 mM, pH 9, Tris-

HCl bufer məhlulundan ibarətdir. Fermentin aktiv-

liyi 340 nm dalğa uzunluğunda 1 dəqiqə  ərzində 

spektrofotometrik küvetdə olan NAD·H-ınsərf 

olunması hesabınaoptiki sıxlığının azalmasına  əsa-

sən təyin edilmişdir. NADH və NADPH üçün eks-

tinksiya  əmsalı 340 nm dalğa uzunluğunda 6,22 

mМ·sm


-1

götürülmüşdür. 



NAD-MDH-nın molekul çəkisinin təyini: 

NAD-MDH-nın və onun subvahidlərinin nisbi mo-

lekul kütlələri gel-elektroforez üsulu ilə  təyin 

olunmuşdur (Laemmli, 1970). Elektroforez zamanı 

β-qalaktozidaza (116 kDa), öküzün zərdab albumini 

(BSA) (66,2 kDa), yumurta albumini (45 kDa), 

laktatdehidrogenaza (35 kDa), restriktion endonuc-

leaza BSP981 (25 kDa), α-laktoqlobulin (18,4 kDa) 

və lizosim (14,4 kDa) zülal-markerləri istifadə 

olunmuşdur. 



Zülalların miqdari təyini:  Zülalların ümumi 

miqdarı Sedmak, Grossberg üsuluna (1977) əsasən 

təyin olunmuşdur. Dərəcəli əyrinin qurulması üçün 

öküzün zərdab albumini (BSA) istifadə edilmişdir. 



Statistika:  Cədvəl və qrafiklərdə verilən qiy-

mətlər üçdən az olmayan bioloji və analitik təkrar-

ların orta riyazi göstəricilərindən ibarətdir.  

 

 



NƏTİCƏLƏR VƏ ONLARIN MÜZAKİRƏSİ 

 

Alınan nəticələr göstərir ki, amarant yarpaq-

larında NAD-MDH bitkinin inkişafının 40-60-cı 

günlərində optimal aktivliyə malik olur. Fermentin 

aktivliyi gün ərzində iqlim amillərinin (temperatur, 

işığın intensivliyi, fotoperiod, rütubət və s.) səviy-

yəsi ilə xarakterizə olunan sutkalıq tsikldən də ası-

lıdır. NAD-MDH günorta saatlarında (12-15

00

)ən 


yüksək aktivliyə malik olmuşdur. Güman etmək 

olar ki, günorta saatlarında temperatur, işıq və s. 

amillərin intensivliyinin artması, rütubətin isə 

azalması ağızcıqların bağlanmasına səbəb olub stres 

zamanı fotosintezin işini tənzimləyir.

 

Reaksiya və homogenizasiya mühitlərinin pH-ı 



da fermentlərin aktivliyinə  təsir edən  əsas amil-

lərdən hesab olunur. Belə ki, amarant yarpaqlarında 

NAD-MDH pH-ın 7,5-8,0 qiymətlərində optimal 

aktivlik göstərmişdir. Reaksiya mühiti üçün optimal 

hesab olunan bu göstərici homogenizasiya mühiti-

nin pH göstəricisindən müəyyən qədər fərqlənmək-

lə 8,0-8,2 qiymətinə malik olmuşdur. 



H.Q. Babayev 

41 


Məlumdur ki, C

4

-bitkilər C



3

-bitkilərlə müqayi-

sədə ekstremal mühit amillərinin təsirinə qarşı daha 

çox davamlılıq göstərdiklərindən, amarant etalon 

bitki kimi götürülməklə onun yarpaqlarında NAD-

MDH-nın aktivliyi, lokalizasiyası  və izoferment 

tərkibi öyrənilmişdir.  

Şəkil 1A və  cədvəl 1-dən göründüyü kimi, 

çiçəkləməönü fazada amarant yarpaqlarının MH və 

ÖTH-nin sitozol fraksiyalarında kontrol və quraqlıq 

variantlarında NAD-MDH aktivliyi quraqlığın baş-

lanğıcında bir-birinə yaxın olmuşdur. Amarantın in-

kişafının çiçəkləmə  və toxumyetişmə fazasında isə 

bunun əksinə olaraq hər iki variantda fermentin ak-

tivliyi çiçəkləməönü fazaya nisbətən artmış  və bu 

artım quraqlıq variantlarda kontrolla müqayisədə 

daha yüksək olmuşdur. Bu mənzərə növbəti fazalar-

da dadavam etmiş və vegetasiyanın sonunda toxum 

yetişmə mərhələsinə nisbətən hər iki variantda fer-

mentin aktivliyi kəskin şəkildə azalmışdır.   

 

 

 



 

Şəkil 1. Quraqlıq  şəraitində amarant yarpaqlarının MH və ÖTH-nin SHF-da 

NAD-MDH aktivliyinin dəyişmə dinamikası. A - sitozol, B - xloroplast, C - 

mitoxondri, MH - mezofil hüceyrələri, ÖTH - örtük topa hüceyrələri, K - 

kontrol, Q - quraqlıq, OA – oksalasetat. 

 

 

 




Quraqlıq Stresi Zamanı Amarant Yarpaqlarının 

42 


Cədvəl 1Amarant yarpaqlarının MH və ÖTH-də ontogenezdə NAD-MDH aktivliyinin subhüceyrə 

paylanması.



 

Hüceyrə,   

variant 

NAD-MDH aktivliyi 

Xloroplast Sitoplazma Mitoxondri 

EU/mg zülal 



EU/mg zülal

% EU/mg 

zülal % 

Çiçəkləmə önü 

MH K 

18,3 12,9 62,7 36,5 114,6 50,6 



21,5 8,5 58,6 28,6 

125,0 

62,9 


ÖTH K 

17,7 8,4 50,4 32,3 

125,5 

59,3 


20,6 5,0 49,4 23,8 

133,6 

71,2 


Çiçəkləmə 

MH K 

21,6  9,63 75,3 35,6 125,5 55,9 



26,1  10,8 85,6 35,4 130,4 53,9 



ÖTH K 

18,0 9,1 51,1 24,3 

139,8 

66,6 


23,4 5,1 79,5 32,6 

151,9 

62,3 


Toxum yetişmə 

MH K 

14,3 8,5 67,5 29.4 

135,7 

62,1 


17,3  3,37 89,4 36,3 148,3 60,3 



ÖTH K 

6,7  3,29 52,3 25,7 144,4 71,0 



7,4 1,6 79,5 

34,3 

157,0 


64,1 

Vegetasiyanın sonu 

MH K 

1,0  2,8  16,3 35,6 28,0 62,2 



0,5  1,5  12,6 37,9 20,0 60,6 



ÖTH K 

0,4  0,8 4,5 6,9 60,8 92,3 



0,2  0,6 3,5 9,8 31,9 89,6 

Qeyd: MH-mesofil hüceyrəsi, ÖTH-örtük topa hüceyrəsi, K-kontrol, Q-quraqlıq 

 

 



Amarant yarpaqlarının MH və ÖTH-nin 

 

mNAD-MDH-sının aktivliyi (Şəkil 1C)  bütün 



ölçülən fazalarda sitozol (Şəkil 1A) və xloroplast 

(Şəkil 1B) fraksiyalarına nisbətən xeyli yüksək 

olmuşdur. Quraqlığın təsirindən fermentin aktivliyi 

artmış, yalnız vegetasiyanın sonunda fermentin ak-

tivliyində azalma baş vermiş, amma bu azalma 

digərləri ilə müqayisədə nisbətən zəif getmişdir. 

Belə ki, çiçəkləməönü ÇÖ fazada mNAD-MDH-

nın zülala görə aktivliyi sitozol və xloroplast 

fraksiyalarında lokalizasiya olunan fermentin zülala 

görə ümumi aktivliyindən uyğun olaraq ~2,5 və 8 

dəfə, Ç fazasında qeyd olunan bu göstərici sitozol 

fraksiyadan ~2, xloroplast fraksiyasından isə ~8, 

bəzən də 10 dəfəyədək yüksək olmuşdur. Vegetasi-

yanın sonuna yaxınlaşdıqca bu fərq daha da art-

mışdır. 

Müəyyən olunmuşdur ki, amarant yarpaq-

larında NAD-MDH geniş izoferment spektrinə 

malikdir və quraqlığın təsirindən izoenzim 

spektrində müəyyən dəyişikliklər baş verir. Belə ki, 

bitkinin inkişafının çiçəkləmə fazasında yarpağın 

subhüceyrə fraksiyalarında stresin ilkin vaxtlarında 

fermentin molekul çəkiləri 58, 63, 68, 72 və 77 kDa 

olan 5 izoformasının olduğu müşahidə olunmuşdur. 

Bu izoformalar subhüceyrə fraksiyaları üzrə 

aşağıdakı kimi paylanmışlar: Kontrolda 58, 63, 68 

və 77 kDa m.ç. izoformalar MH-nin, 63 və 72  kDa 

m.ç. izoformalar isə ÖTH-nin sitozolunda, 63 kDa-

luq izoforma MH və ÖTH-nin xloroplastında, 63, 

68 və 77 kDa m.ç. izoformalar isə MH və ÖTH-nin 

mitoxondri fraksiyalarında lokalizasiya olunmuşlar.   

Çiçəkləməönü və çiçəkləmə fazalarında MH-

nin sitozolunda kontrolda NAD-MDH-nın heç bir 

izoforma dəyişikliyi baş verməmişdir. Çiçəkləmə 

mərhələsində  həmin fraksiyada quraqlığın təsi-

rindən 63 və 68 kDa m.ç. izoformalar itmişdir. 

Toxumyetişmə fazasında isə MH-nin sitozolunda, 

kontrol variantlarda 63, 68 və 77 kDa m.ç. 

izoformalar itmiş, yalnız 58 kDa m.ç. izoforma 

qalmışdır. Bu zaman quraqlığın təsirindən 58 və 77 

kDa m.ç. izoformalarla yanaşı 72 kDa m.ç. induktiv 

izoforma  əmələ  gəlmişdir. Vegetasiyanın sonunda 

bütün izoformalar yox olmuş  və yalnız kontrolda 

MH-nin sitozol fraksiyasında 58 kDa m.ç. izoforma 

saxlanmışdır. 

MH ilə müqayisədə ÖTH-nin sitozolunda 

stresin təsirindən baş verən izoenzim dəyişikliyi 

fərqli olmuşdur. Belə ki, bu fraksiyada çiçəkləmə-

önü mərhələdə kontrol və quraqlıq variantlarında 

63 və 72 kDa m.ç. malik 2 konstitutiv izoforma 

vardır. Çiçəkləmə  mərhələsində fermentin izofer-

ment spektri dəyişmiş və kontrol variantlarda əlavə 

olaraq 58 və 77 kDa m.ç. 2, quraqlıqda isə 58 kDa 

m.ç. bir induktiv izoforma əmələ  gəlmişdir. To-

xumyetişmə  mərhələsində isə kontrolda yalnız 58, 

quraqlıqda isə 58 kDa m.ç. izoforma ilə yanaşı 68 

kDa m.ç. induktiv izoforma aşkarlanmışdır. Vege-

tasiyanın sonuna doğru bu izoformaların inten-

sivliyi kəskin aşağı düşmüşdür. 




H.Q. Babayev 

43 


Bitkinin  inkişafının çiçəkləməönü və çiçək-

ləmə  mərhələlərində  hər iki toxumanın mitoxondri 

fraksiyalarında kontrolda NAD-MDH-nın 63, 68 və 

77 kDa m.ç. malik olan 3 izoformasından çiçək-

ləməönü mərhələdən başlayaraq quraqlıq təsirindən 

hər iki toxumada 77 kDa m.ç. izoforma yox olmuş, 

çiçəkləmə mərhələsində isə hər iki toxumada və hər 

iki variantda 58 kDa m.ç. malik bir ədəd induktiv 

izoforma aşkarlanmışdır. 

Toxumyetişmə mərhələsində isə MH və ÖTH-

nin mitoxondri fraksiyalarında kontrol variantlarda 

58 kDa m.ç. induktiv izoforma yox olmuş  və 

quraqlıq variantlarda isə 58 kDa m.ç. izoforma 

saxlanmaqla ÖTH-nin mitoxondrilərində 72 kDa 

m.ç. izoforma yenidən əmələ gəlmişdir.  

Amarant yarpaqlarının NAD-MDH-nın izofer-

ment spektrində yaranan müxtəliflik, görünür hə-

min toxumalarda baş verən metabolizm xüsusiy-

yətləri və adaptasiya mexanizmləri ilə əlaqədardır. 

Alınan nəticələr bir daha təsdiq edir ki, C

4

-

bitkilər iki növ fotosintezedici toxumaya malik 



olduqlarından və streslə əlaqədar olaraq təkamüldə 

bitkinin yarpaqlarının anatomik quruluşlarında ya-

ranan mürəkkəblik onların ferment sistemlərininin 

fəaliyyətində  və izoferment tərkibində  də mürək-

kəbliyin yaranmasına səbəb olmuşdur. 

1998-ci ildə Berkemeyer və b. Arabidopsis 

bitkisində plastid NAD-MDH-sının (pNAD-MDH) 

klonlaşmasını, heteroloji ekspressiyasını öyrənmiş 

və in vitro xarakteristikasını vermişlər (Berkemeyer 

et al., 1998). NADF-MDH-dan fərqli olaraq, 

pNAD-MDH izolə edilmiş xloroplastlarda istər 

işıqda, istərsə  də qaranlıqda aktivdir və  işıqda hər 

iki fermentin aktivliyi eyni səviyyədə olur (Ber-

kemeyer et al., 1998). Əvvəlki işlərdə  in vitro 

pNAD-MDH-nın,  əsasən, OA-ın malata reduksiya 

reaksiyasını kataliz etdiyi göstərilmışdir (Cvetić et 

al., 2008; Beeler et al., 2014). Beləliklə, elektron 

akseptoru NAD-ın plastidlərin daxilində regene-

rasiyasının həyata keçirilməsi pNAD-MDH-nın  ən 

çox ehtimal edilən fizioloji roludur. Beləliklə, 

yarpağın tənəffüsü zamanı mMDH-nın köməyi ilə 

əmələ  gələn malat reduksiyaedici ekvivalentləri 

dolayı yolla plastidlərə çatdırır. Qeyd etmək lazım-

dır ki, Arabidopsisdə qaranlıqda mMDH-1-də ma-

latın miqdarının artması reaksiyanın istiqaməti haq-

qında  əvvəllər söylənilən fərziyyəni  şübhə altına 

alır. Bu artmanın sadə izahı ondan ibarətdir ki, 

normal bitkidə gecə pNAD-MDH-sı malatın OA-a 

oksidləşməsini kataliz edir və beləliklə  də NADH 

əmələ  gəlir. Lakin, təbii bitkidə  və mMDH-1-də 

NAD(H) pulunun miqdarı  və oksidləşmə  vəziy-

yətinin eyni olması bu fərziyyəni şübhə altına alır. 

Lakin ola bilər ki, NAD(H) pulundan keçən axın  

mMDH-1-də  dəyişsə  də oksidləşmə  vəziyyətində 

faktiki dəyişiklik yaratmır (Selinski et al., 2014; 

Beeler et al., 2014).

 

sNAD-MDH-ları mNAD-MDH-ya nisbətən 



zəif öyrənilmişdir. sNAD-MDH-sının bir sıra 

məkik mexanizmlərdə, substratların və reduksi-

yaedici ekvivalentlərin sitoplazma ilə digər hüceyrə 

orqanoidləri arasında mübadiləsində  iştirak edir 

[Yu Ding, Qing-Hu Ma, 2004]. 

Fermentlərin vacib xassələrindən biridə tempe-

ratura həssaslıqdır. Temperatur hüceyrə daxilində 

ferment sistemlərinin aktivliyinin tənzimində, 

biokimyəvi çevrilmələrdə, ferment molekulu ilə 

ferment-substrat kompleksi arasında tarazlığın 

yaranmasında mühüm rol oynayır (Cook, Cleland, 

2007; Cornish-Bowden, 2012).Temperatur fermen-

tin stabilliyinə, ferment-substrat kompleksinin 

parçalanmas sürətinə, fermentin substratla uyğun-

luğuna, fermentlə aktivator və inhibitorun yaxın-

lığına təsir edir (Cornish-Bowden, 2012). 

Amarantın inkişafının çiçəkləmə mərhələsində 

subhüceyrə fraksiyalarında aldığımız nəticələr 

göstərir ki, bütün fraksiyalarda temperaturun tədri-

cən 45


o

C-dək yüksəlməsi fermentin aktivliyinin 

artmasına səbəb olmuşdur (Şəkil 2). 45-55

o

C tem-



peraturda reaksiyanın sürəti maksimal olmuş, tem-

peraturun sonrakıartımında isə reaksiyanın sürəti 

azalmağa başlamış  və 70-80

o

C-də minimuma en-



mişdir. 60

o

C-dən yuxarı temperaturun NAD-MDH 



aktivliyinə inhibirləşdirici təsiri çox güman ki, 

ferment zülalının nativ strukturunun denaturasiya 

ilə  əlaqədardır. Müəyyən olunmuşdur ki, MH və 

ÖTH-nin sNAD-MDH-nın aktivliyi 45-50

o

C tem-


peraturda quraqlıq təsirindən kontrolla müqayisədə 

~2,5 dəfə yüksək olmuşdur. Bu nəticə quraqlıq 

təsirindən fermentin zülalının miqdarının artması 

ilə  əlaqədar ola bilər.  Ədəbiyyatda bu nəticələrə 

uyğun nəticələr mövcuddur. Belə ki, ədəbiyyat 

məlumatlarında müxtəlif mənbədən alınmış MDH-

ların optimal temperatur göstəriciləri 30-60

o



intervalı göstərilir (Пинейру и др., 1991). 

Məlumdur ki, fermentativ reaksiyaların sürəti 

fermentin substratlarının qatılığından birbaşa asılı-

dır (Cornish-Bowden, 2012). Bu məqsədlə yüksək 

təmizlənmiş ferment preparatı ilə NAD-MDH-nın 

kataliz etdiyi düzünə  və  əksinə reaksiyaların sürə-

tinin fermentin substratları olan OA və malatın 

qatılığından asılılığının dəyişmə dinamikası  tədqiq 

olunmuşdur (Cədvəl 2). Cədvəldən göründüyü kimi 

amarant yarpaqlarının subhüceyrə fraksiyalarında 

lokalizasiya olunan izoformalar normal suvarma 

şəraitində OA-ın qatılığı 1,0 mM olduqda reak-

siyanı daha yüksək sürətlə kataliz edirlər. Quraq-

lığıntəsirinə  məruz qalmış variantlarda OA-ın 1,0 

mM qatılığında NAD-MDH-nın aktivliyi normal 

suvarılan bitkilərlə müqayisədə 20% yüksək ol-

muşdur. 

 

 




Quraqlıq Stresi Zamanı Amarant Yarpaqlarının 

44 


  

a)

 

b)

 

c)

 

d)

 

Şəkil 2. Çiçəkləmə fazasında amarant yarpaqlarının MH və ÖTH-nin sitozol və mitoxondri  fraksiyalarında 

temperaturun NAD-MDH aktivliyinə təsirinin kinetikası. 1 - Kontrol, 2 - Quraqlıq, A - Mixaelis-Menten,  

B - Arrenius qrafiki, a - MH sitozol, b - MH mitoxondri, c - ÖTH sitozol, d - ÖTH mitoxondri. 



H.Q. Babayev 

45 


Cədvəl 2. Çiçəkləmə fazasında amarant yarpaqlarının MH və ÖTH-nin subhüceyrə fraksiyalarında NAD-MDH-nın 

kataliz etdiyi reaksiyaların bəzi kinetik parametrləri.

 

Toxuma 

Fraksiya 

Variant 

OA 

(0,1-10 mM) 

Malat 

(5-100 mM) 

NADH 

(0,02-1 mM) 

MgCl



(1-50 Mm) 

ATF 

(0,1-3 mM) 

K

m

 

V

max

 

K

m

 

V

max

 

K

m

 

V

max

 

K

m

 

V

max

 

K

i

 

V

max

 

MH 

Sit 

1,54 80,72  17  205 0,156 80  3,9  42  1,5  38 



1,89 91,03  20  219 0,16 130 4,2  99  2,1  98 



Xlp 

3,2 12,02  9  22 0,25 71 6,5  13,6  3,0  10,5 



2,9 9,53 11 19,5 0,2 62 6,3 10,6 2,8  9,32 



Mit 

2,5 30,8 12,5 

101 0,17 140 2,8 128 1,3 127,1 

3,30 40,01 11,4 185  0,2  160 4,0  134  1,2  131,2 



ÖTH 

Sit 

1,94 80.76 23,5 230 0,148 80,1 4,8  79,1  1,25  75 



1,7 100,2 22,5 239 0,15 99,0 4,5  99,1 2,25  96 



Xlp 

1,3 23,03 11,5 35,0 0,3  24 4,2  22,8  1,6  21,6 



1,4 23,61 11,8 42,2 O,25 34 4,06 20,96 1,4  20,6 



Mit 

1,5 134.2 4,3 123 0,18 140 4,7 131,2 1,2  127 



2,0 141.7 5,2 149 0,16 160 6,0 137,9 0,9  133,6 



Qeyd: Sit - sitozol fraksiyasə, Xlp – xloroplast  fraksiyası, Mi t - mitoxondri fraksiyası. 

 

 



Cədvəldən göründüyü kimi amarant bitkisinin 

MH-nin sitozolunda kontrolda K

m

OA=1,54 mM, 



V

max


OA=80,7 EU/mq zülal, quraqlıqda K

m

OA=1,89 



mM, V

max


OA=91 EU/mq zülal olduğu halda MH-nin 

mitoxondrilərində kontrolda K

m

OA=2,5 mM, 



V

max


OA=30,8 EU/mq zülal, quraqlıqda K

m

OA=3,3 



mM, V

max


OA=40,1 EU/mq zülal olmuşdur.  

Amarantın ÖTH-də kontrolda sitozolda K

m

OA= 


1,94 mM, V

max


OA=80,7 EU/mq zülal, quraqlıqda 

K

m



OA=1,7 mM, V

max


OA=100,2 EU/mq zülal 

olduğu halda ÖTH-nin mitoxondrilərində kontrolda 

K

m

OA=1,5 mM, V



max

OA=134,2 EU/mq zülal, 

quraqlıqda  K

m

OA=2,0 mM, V



max

OA=141,7 EU/mq 

zülal olmuşdur. 

Alınan nəticələri analiz etdikdə məlum olur ki, 

amarant bitkisinin yarpaqlarında NAD-MDH-nın 

kataliz etdiyi reaksiyanın OA-a görə K

m

-ləri buğda 



sortlarının flaq yarpaqlarındakı  həmin göstəricidən 

aşağı qiymətə malik olub 1,2-2,1 mM aralığında 

yerləşir. Amarant yarpaqlarının ÖTH-də baş verən 

həmin reaksiyanın V

max

-u isə buğdanın flaq 



yarpaqlarının MH-nin subhüceyrə fraksiyaları ilə 

müqayisədə 3-5 dəfə çoxdur. Amarantın ÖTH-də 

V

max


OA MH-dəki V

max


OA-dan həmişə yüksək 

olmuşdur. Q təsirindən K ilə müqayisədə bu fərq 

daha da artmışdır. Amarantın MH-nin SHF-ı arasın-

da sitozol fraksiyada V

max

 mitoxondri fraksiyasına 



nisbətən ~2 dəfə çox olmuşdur. Amarant yarpaqla-

rında MH ilə ÖTH-nin sitozol fraksiyalarında 

kontrol və quraqlıq variantlarında K

m

  və  V



max

-lar 


təqribən bir-birlərinə  bərabər olsalar da ÖTH-nin 

mitoxondri fraksiyasında V

max

OA MH-nin mito-



xondri fraksiyasına nisbətən ~3-4 dəfə yüksək 

olmuşdur.   

Alınan nəticələr MDH-nın OA-a qarşı yüksək, 

malata qarşı isə  aşağı  həssaslığının olduğunu 

göstərir ki, bu da başqa tədqiqatçıların nəticələri ilə 

uyğunluq təşkil edir. Əvvəllər aparılmış  tədqiqat-

larda göstərirlər ki, malata qarşı fermentin aşağı 

həssaslığa malik olması malatın katalitik çevrilməsi 

zamanı fermentin konformasiya dəyişkənliyi ilə 

əlaqədardır (Wisemann et al., 1991; Сатар  и  др., 

2010). 

K



qiymətlərinin müqayisəsi göstərir ki, 

sNAD-MDH malata qarşı OA-la müqayisədə az 

uyğunluq göstərir. K

m

 qiymətləri bitkinin növün-



dən, mübadilənin tipindən, hüceyrə daxilində yerinə 

yetirdiyi funksiyasından və boyümə  şəraitindən 

asılı olaraq dəyişə bilir. 

NAD-MDH fermentinin ayrı-ayrı izoformaları 

xüsusi aktivliyinə, reaksiyanın sürətinə, düzünə  və 

əksinə gedən reaksiyanın katalitik effektivliyinə 

görə biri-birindən fərqlənirlər. Düzünə  və  əksinə 

gedən reaksiyada NAD-MDH-nın kinetik para-

metrlərinə görə fərqlənən 2 müxtəlif konformasion 

vəziyyətdə olur (Блюменфельд, Плешанов, 1986). 

Malatın oksidləşməsi  əlavə energetik baryerin ara-

dan qaldırılması  və katalitik akt zamanı mole-

kulların strukturunda əhəmiyyətli konformasiya 

dəyişikliklərin baş verməsi ilə müşayiət olundu-

ğuna görə reaksiya sabit sürətlə baş vermir. Malat 

həyacanlanmış  vəziyyətindən sakit vəziyyətinə ke-

çərək ayrılan hidrogen ionunu kofermentə ötürərək 

substrat molekulu ilə MDH birləşməsinə  şərait 

yaradır. Yalnız reaksiya məhsulları ayrıldıqdan və  

MDH molekulu başlanğıc konformasiya vəziy-

yətinə qayıtdıqdan sonra  substratın yenidən kata-

litik çevrilməsi baş verir. Bu keçidlərlə  əlaqədar 

olaraq katalitik prosesin sürəti zəifləyir. OA-ın 

çevrilmə reaksiyası fermentin strukturunda baş 

verən konformasiya dəyişkənlikləri ilə  əlaqədar 

deyildir. 

Alınan nəticələr  əsasında belə bir mülahizə 

yürütmək olar ki, su stresi şəraitində    ağızcıqların 




Quraqlıq Stresi Zamanı Amarant Yarpaqlarının 

46 


bağlanması ilə  əlaqədar olaraq bitkilərdə yaranan 

CO

2



  qıtlığının qarşısını almaq üçün bitkilərin 

istifadə etdiyi alternativ yollardan biri hüceyrələrdə 

MDH-lar hesabina C

4

-turşuların sintezinin sürətlən-



məsidir. Mitoxondri NAD-MDH-sının aktivliyinin 

artması mitoxondrilərdə  C

4

-turşuların sintezini 



artırır. C

4

-turşuların sintezinin artması quraqlıqda 



ağızcıqların bağlandığı  və qaz mübadiləsinin zəif-

lədiyi  şəraitdə karbon qatılaşdıran mexanizmin işə 

düşməsinə  səbəb olur ki, bunun da nəticəsində 

Kalvin dövranı CO

2

 ilə təmin edilir (Amthor, 2010; 



Wang et al., 2014). 

 

 



 

ƏDƏBİYYAT 

 

Бальнокин Ю.В., Котов А.А., Мясоедов Н.А., 

Хайлова  Г.Ф.,  Куркова  Е.Б.,  Леньков  Р.В., 

Котова  Л.М.  (2005)  Участие  дальнего  транс-

порта Na


+

  в  поддержании  градиента  водного 

потенциала    в  системе  среда-корень-лист  у 

галофита  Suaeda altissima.  Физиология  расте-



ний, 52: 549-557. 

Блюменфельд  Л.А.,  Плешанов  П.Г.  (1986)  

Единичные  циклы  прямой  ферментативной 

реакции  напримере  МДГ.  Биофизика,  30(5): 

760-763. 



Пинейру  де  Корвалью  М.А.А.,  Землянухин 

А.А.,  Епринцев  А.Т.  (1991)  Малатдегидро-

геназа  высших  растений.  М.А.А.  Пинейру  де 

Корвалью, A.A. Землянухин,  А.Т.  Епринцев. 

Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та., 216 с.  



Сатар  А.Ф.,  Парфенова  И.В.,  Мальцева  Е.В., 

Фалалеева М.И., Епринцев А.Т. (2010) Кине-

тические  характеристики  тетрамерной  формы 

малатдегидрогеназы,  полученной  с  использо-

ванием  ионообменной  хроматографии,  из 

животных  и  бактерий.  Сорбционные  и  хрома-

тографические процессы10(2): 231-236. 

Amthor J.S. (2010) From sunlight to phytomass: 

on the potential efficiency of converting solar 

radiation to phytoenergy. New Phytologist.,  188: 

939-959. 



Beeler S., Liu H-C., Stadler M., Schreier T., 

Eicke S., Lue W-L., Truernit E., Zeeman S.C., 

Chen J., Kötting O. (2014) Plastidial NAD-

dependent malate dehydrogenase is critical for 

embryo development and heterotrophic meta-

bolism in Arabidopsis.  Plant Pysiology., 164: 

1175-1190. 

Berkemeyer M., Scheibe R., Ocheretina O. 

(1998) A novel, non-redoxregulated NAD-depen-

dent malate dehydrogenase from chloroplasts of 

Arabidopsis thaliana L. J. Biol. Chem., 273: 

27927-27933. 



Cook P., Cleland W. (2007) Enzyme kinetics and 

mechanism. New York, USA: Garland Sci., 416 p. 



Cornish-Bowden A. (2012) Fundamentals of enzy-

me kinetics. New York, USA: Wiley-Blackwell, 

510 p. 

Cvetic T., Veljovic-Jovanovic S., Vucinic Z. 

(2008) Characterization of NAD-dependent mala-

te dehydrogenases from spinach leaves. Proto-

plasma, 232: 247–253.

 

Fedoroff N., Battisti D., Beachy R. et al. 

(2010) Radically rethinking agriculture for the 

21st century. Science, 327: 833–834. 



Flexas J., Bota J., Galmes J. et al. (2006) Keeping 

a positive carbon balance under adverse condi-

tions: responses of photosynthesis and respiration 

to water stress. Physiologia Plantarum, 127: 343-

352. 

Gietl C. (1992) Malate dehydrogenase isoenzymes: 

cellular locations and role in the flow of meta-

bolites between the cytoplasm and cell organelles. 

Biochim. Biophys. Acta1100: 217-234. 

Guliev N.M., Babaev G.G., Bairamov Sh.M. 

Aliev D.A. (2003) Purification, properties, and 

localization of two carbonic anhydrase from 



Amaranthus cruentusleaves.  Russian Journal of 

Plant Physiology, 50(2): 213-219. 

Laemmli U. (1970) Cleavage of structural proteins 

during the assembly of the head of bacteriophage 

T4. Nature, 227(5259): 680-685. 

Murata N., Takanashi S., Nishiyama Y., Allakh-

verdiev S. (2007) Photoinhibition of photosystem 

II under environmental stress. Biochem. et 



Biophys. Acta, 258: 100-107. 

Nunes-Nesi A., Carrari F., Gibon Y. et al. (2007) 

Deficiency of mitochondrial fumarase activity in 

tomato plants impairs photosynthesis via an effect 

on stomatal function. Plant J.50(6): 1093-106. 



Sedmak, J., Grossberg, S. (1977) A rapid, sensi-

tive and versatile assay for protein using Coomas-

sie brilliant blue G-250. Anal. Biochem., 79: 544-

552. 


Selinski J., Konig N., Wellmeyer B. et al. (2014) 

The plastid-localized NAD-dependent malate 

dehydrogenase is crucial for energy homeostasis 

in developing 



Arabidopsis thaliana seeds. Mol. 

Plant.,  7: 170–186. 

Scheibe R., Stitt M. (1988) Comparison of NADP-

malate dehydrogenase activation, QA reduction 

and O

2

 reduction in spinach leaves. Plant Physiol. 



Biochem., 26: 473–481. 

Tomaz T., Bagard M., Pracharoenvwattana I., et 

al.  (2010) Mitochondrial malate dehydrogenase 

lowers leaf respiration and alters photorespiration 

and plant growth in Arabidopsis. Plant Physi-

ology, 154: 1143-1154. 

Wang Yu, Brautigam A., Weber A., Zhu X. 

(2014) Thre distinct biochemical subtypes of C

4

 

photosynthesis? A modeling analysis. J. of Exp. 



Botany53(7): 3568-3578. 


H.Q. Babayev 

47 


Wisemann M., McKay D., Crow K. et al. (1991) 

Rat liver mitochondrial malate dehydrogenase: 

purification? Kinetic properties, and role in 

ethanol metabolism. Arch. Biochem. Biophys., 



290(3): 191-196. 

Yashvant P., Ram N., Kumari S.  et al. (2013) A 

new antibiotic resistant mutant of Pleurotus sajor-



caju with improved expression of malate 

dehydrogenase enzyme. IJALS, 6(1):36-43. 



Yu Ding, Qing-Hu M. (2004) Characterization of a 

cytosolic malate dehydrogenase cDNA which 

encodes an isizyme toward oxaloacetate reduction 

in wheat. Biochimie., 86: 509-518. 

 

 

 

Исследование НАД-Малатдегидрогеназы Цитозольных И Митохондриальных  



Фракций Листьев Амаранта В Условиях Засухи 

 

Г.Г. Бабаев  

 

Институт молекулярной биологии и биотехнологии НАНА 

 

Изучены  локализация,  изоферментный  спектр,  некоторые  физико-химические  и  кинетические 



свойства  НАД-малатдегидрогеназы (L-малат-НАД-оксидоредуктаза,  НАД-МДГ,  КФ 1.1.1.37) в 

цитозольных  и  митохондриальных  фракциях  мезофильных  (М)  и  обкладочных  клеток  (ОК) 

амаранта  в  фазах  цветения  и  созревания  зерна  под  воздействием  засухи.  В  зависимости  от  фазы 

развития и типа ткани НАД-МДГ имеет широкий изоферментный спектр, и под действием засухи 

наблюдаются выраженные изменения в количестве изоферментов,  в ферментативной активности, а 

также  в  физико-химических  и  кинетических  свойствах  фермента.  Значение  V

max

ОАА  для 



цитоплазматической  НАД-МДГ  (цНАД-МДГ)  в 2 раза  больше,  чем  для  митохондриальной  НАД-

МДГ (мНАД-МДГ). Все изоформы фермента имеют широкий оптимум рН и устойчивы к действию 

температуры.  В  зависимости  от  субклеточной  фракции  фермент  проявляет  высокую 

чувствительность  к  своему  сусбтрату – OAA и  низкую  чувствительность  к  малату.  Реакция, 

катализируемая  НАД-МДГ,  в  основном  подчиняется  кинетике  Михаэлиса-Ментена,  и  фермент  не 

является  аллостерическим.  Активность  фермента  строго  регулируется  промежуточными  субстра-

тами и одно- и двухвалентными ионами. 

 

Ключевые  слова:  Aмарант,  клетки  мезофилла,  клетки  обкладки,  НАД-малатдегидрогеназа, 

изоформа, локализация, засуха, адаптация 

  

 

The Study of NAD-Malatedehydrogenase in Cytosolic And Mitochondrial  



Fractions of Amaranth Leaves Under Drought 

 

H.G. Babayev  

 

Institute of Molecular Biology and Biotechnology, ANAS 

 

Localization, isoenzyme spectrum, some physicochemical and kinetic properties of NAD-malate 

dehydrogenase (L-malate-NAD-oxidoreductaseNAD-MDH, EC 1.1.1.37) have been studied in cytosolic 

and mitochondrial fractions of mesophyll (M) and bundle sheath cells (BSC) of amaranth leaves during the 

flowering and grain ripening phases under drought. Depending on the growth phase and tissue type NAD-

MDH has a wide isoenzyme spectrum and pronounced alterations were observed in the isoenzyme number 

and the enzyme activity and also in physicochemical and kinetic properties. V

max


 OAA for cytoplasmic 

NAD-MDH (sNAD-MDH) was 2 times more than that of mitochondrial NAD-MDH (mNAD-MDH). All 

isoforms of the enzyme have a wide pH optimum and are temperature tolerant. Depending on the 

subcellular fraction the enzyme is highly sensitive to OAA and manifests low sensitivity to malate. The 

reaction catalyzed by NAD-MDH generally follows Michaelis-Menten kinetics and the enzyme is not 

allosteric. The enzyme activity is strongly regulated by intermediate substrates and divalent ions.  



 

Key words: Amarant, mesophyll cells, bundle sheath cells, NAD-malatdehydrogenase, isoform, 

localization, drought, adaptation  

: uploads -> journal
journal -> Beynin Şərti Reflektor Fəaliyyətinin Emosiogen Tənzimlənməsində Serotoninergik Sisteminin Sinaptik Mexanizmləri
journal -> A sexual violation in an analytic treatment and its personal and theoretical aftermath
journal -> Virtuoz Cərrah, Görkəmli Dövlət Və Elm Xadimi
journal -> Microsoft Word Bas redaktordan
journal -> Və Plastronun Morfoloji Xüsusiyyətləri
journal -> Abşeronda Meyvə Bağlarına Zərərverən Başlıca Qabıqyeyən Böcəklər
journal -> Təbiətin ölkəmizə bəxş etdiyi zəngin sərvətlərə xüsusi qayğı ilə yanaşmaq, belə misilsiz xəzinələri
journal -> Gəncə-Qazax Florasının Nadir Növləri Və Yeni Taksonlar T. S. Bab akişiyeva
journal -> Quraqlıq Və Duz Stresləri Şəraitində Buğda Genotiplərində Rubisko, Rubisko aktivaza Və Fosfoenolpiruvat karboksilazanın Zülal Səviyyələrinin Dəyişilməsi


Dostları ilə paylaş:


Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©genderi.org 2019
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə