162
Restriksiya fraqmentinin uzunluq polimorfizmi (Restriction Fragment Lenght
Polymorphisms, RFLP): İlk kəşf edilən molekulyar marker sistemidir. Əsas prinsipi
restriktazalar vasitəsilə parçalanmış DNT fraqmentlərinin elektroforetik üsulla
identifikasiyasından ibarətdir. Restriktaza adlanan fermentlər endonukleazalara aid
olub, DNT molekulunu ancaq müəyyən yerlərdən parçalamaq qabiliyyətinə
malikdirlər. Restriksiya fraqmentinin uzunluq polimorfizmi (restriction fragment
length polymorphism-RFLP) adlanan metod alınmış restriksiya fermentlərinin
aqaroza gelində elektroforezi və ethidium bromid ilə boyadıldıqdan sonra geldə
əmələ gələn DNT ləkələrinin yeri və sayının standartla müqayisə edilməsinə
əsaslanır. Daha çox DNT-ə olan tələbat bahalı və çox vaxt tələb etməsi texniki
metodun mənfi cəhətini, alınan nəticələrin etibarlılığı və kodominant
(heteroziqotların fenotipində, hər iki allel cütün təsir göstərməsi) marker sisteminə
malik olması isə üstünlüklərini təşkil edir [15; 16].
Təsadüfi DNT hissəsinin amplifikasiyası (Random Amplified Polymorphic
DNA, RAPD): RFLP metodundakı çətinliklərin qarşısını almaq və PCR metodunun
əmələ gətirdiyi üstünlüklərdən faydalanmaq məqsədi ilə RAPD metodu işlənib
hazırlanmışdır. RAPD markerləri qısa zaman ərzində bütöv genom səviyyəsində
böyük miqdarda nümunələrin identifikasiyasını reallaşdırmağa imkan verir. Təsadüfi
xarakterli RAPD markerləri qabaqcadan genom haqqında heç bir informasiya tələb
etmir və eyni zaman ərzində bir neçə gen lokusunu tədqiq etməyə imkan verir. PCR
məhsulları, elektroforez edildikdən sonra ethidium bromid ilə rəngləndikdən sonra
əmələ gələn polimorfik diapazonlar nəzərə alınmaqla davamlı və həssas fərdlər bir-
birindən fərqlənir. İstifadə olunan hər RAPD praymeri üçün yaranan PCR məhsulları
iki qrup daxilində araşdırılır. Birinci dəyişən olaraq adlanır və bunlar nukleotidlərdəki
inversion, delesyon və praymer əlaqə sahəsindəki nukleotid dəyişikliyindən
qaynaqlanır. İkinci isə dəyişən olmayanlar (monomorfiq) adlandırılır [17; 18].
RAPD analizi sadədir, tətbiq olunması tez və asandır. Çoxaltma əməliyyatı
normal PCR şərtlərindən fərqli olmaqla, praymer (13-30 nukleotid uzunluğunda
PCR-in spesifikliyini müəyyənləşdirən sintetik DNT parçasıdır) əlaqələnmə
temperaturu aşağı olmaqla (35-37
0
C) və yalnız bir praymerdən istifadə olunur.
Markerin tətbiqinin tez və asan olması onun üstünlüyünü, yalnız dominant markerlər
yaradılması, PCR əsnasında səhv uyğunlaşmaların olması, PCR şərtlərindəki kiçik bir
dəyişikliyin nəticələrə təsir etməsi və laboratoriyalar arasında təkrarlanma
probleminin mövcudluğu markerin mənfi cəhətidir [19; 20; 21].
Amplifikasiya fraqmentinin uzunluq polimorfizmi (Amplified Fragment Length
Polymorphisms, AFLP): Yeni bir marker sistemi olaraq inkişaf etmişdir (P.Vos və
başq., 1995). Cinsi yolla (valideyn) və seleksiya nəticəsində yaranan fərdlərin DNT
molekulaları iki restriktaza adlanan fermentlərin təsiri ilə parçalanır və DNT
molekulunun parçalanması nəticəsində əmələ gələn DNT hissəcikləri adapterlərlə
(liqasyon) birləşir. Liqasyon (genetik əlaqə) məhsulları bir əsas əlavə edilmiş DNT
zəncirləri ilə (praymerlərlə) PCR olunur və əldə olunan PCR məhsulları 3 əsas əlavə
edilmiş praymerlərlə (praymerin biri radioaktiv və ya fluoresent ilə nişanlanır) seçici
PCR məruz qalır. PCR məhsullarının poliakrilamid gelində elektroforezi nəticəsində
əmələ gələn polimorfizmə görə nəticələr qiymətləndirilir. Tək bir reaksiyada 30-150
163
bölgə müəyyən olunur, nəticələrin təkrarlanması ən əhəmiyyətli üstünlüyüdür. Mənfi
cəhəti isə bahalı olması, laboratoriya avadanlıqlarına tələbat və dominant marker
olmasıdır [15; 17; 21; 22].
Sadə ardıcıllıqlı təkrarlar(Simple Sequence Repeats, SSR: Canlıların
genomunda daha çox təkrarlanan DNT ardıcıllığı vardır. Bu ardıcıllıqlar müəyyən
sayda təkrarlanır. Ardıcıllıqların genomun hansı hissəsində və neçə dəfə təkrarlandığı
növə görə dəyişir. Eyni növ daxilindəki fərdlər arasındakı bu ardıcıllıqların mövcud
olmamasına əsaslanan SSR markeri inkişaf etmişdir. Təkrarlanan bölgələrə xas
spesifik praymerlər inkişaf etdirilmiş və bu praymerlər ilə PCR aparılır. PCR
fermentləri elektroforez edildikdən sonra ethidium bromid və ya gümüş nitrat ilə
boyandıqdan sonra polimorfizm aşkarlanır. Markerin, kodominant olması və
təkrarlanması ən əhəmiyyətli cəhəti, genom məlumatına və sequens analizine ehtiyacı
olması onun mənfi cəhətini təşkil edir [23; 24].
Molekulyar markerlərin təsnifatı.
Dominant markerlər: Allel genlərarası əlaqədə dominantlıq üstünlük təşkil
etdiyindən heteroziqot fərdləri (Aa) təyin etmək mümkün deyildir.
Kodominant markerlər: Allellərarası əlaqədə dominantlıq əsas olmadığından
heteroziqot fərdləri (Aa) homoziqot dominant fərdlərdən (AA) ayırd etmək
mümkündür. Buna görə hər hansı bir nöqtədəki marker üçün 3 müxtəlif şəkil (AA,
Aa və aa) əldə edilə bilər və bunlar bir-birlərindən asanlıqla ayrıla bilər.
Molekulyar markerlərin xüsusiyyətləri.
Molekulyar markerlər morfoloji və biokimyəvi xüsusiyyətlərinə görə bir çox
üstünlüklərə malikdir [24]. Bunlara daxildir:
a)
Genoma bağlı olduqlarından etibarlıdırlar;
b)
Təkrarlana bilir və laboratoriyalar arasında standartlaşdırılması
mümkündür;
c)
Genomda birdən çox bölgəni müəyyən etmə imkanına malikdir;
d)
Ətraf mühit şəraitindən asılı deyildir;
e)
Dominant və kodominant xüsusiyyətlərə malikdirlər;
f)
Bütün toxumalarda təyin oluna bilirlər;
g)
Markerlər öldürücü təsirə malik deyillər.
Genetik ehtiyatların müəyyən edilməsi və qorunması.
Molekulyar markerlər sayəsində gen resurslarının bütün genetik kökləri ilə
əlaqədar olduqca faydalı məlumatlar əldə edilir. Bu məlumatlar seleksiyaçılar üçün
aparılan tədqiqat işlərində xüsusilə nadir olan genləri daşıyan gen resurslarının
istifadə edib etməyəcəklərinə qərar vermədə əhəmiyyətlidir. Dəyişən ekoloji və bazar
tələbləri, mədəni ticari sortlarının inkişaf etdirilməsini zəruriləşdirir. Yeni sortlarda
dəyişik bir meyvə rəngi və ya hər hansı bir xəstəliyə dayanıqlılıq kimi xüsusiyyətlər
tələb oluna bilər. Lazım gəldikdə hər hansı bir xüsusiyyəti, kolleksiyada olan bir
bitkidən hibridləşmə yolu ilə bazar tələblərinə uyğun sortlara köçürülə bilər. Bu
vəziyyətdə, genetik müxtəlifliyin qorunması və lazım olduqda istifadə edilməsi
məqsədi ilə genetik ehtiyatların qorunması və gen qaynaqlarında yer alan genlərin
müəyyənləşdirilməsi lazımdır. Molekulyar markerlərdən istifadə edərək müxtəlif
genetik quruluşlu bitkilər təsbit edilərək qorunur. Çox sürətli polimorfik marker