Microsoft Word Dissertation-Ute-Daig-05. 09. 05. doc

 
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1.3 
Modell der– Anti-Thy-1-Glomerulonephritis der Ratte 
Das Modell der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis der Ratte diente als etabliertes 
Modell einer akuten mesangioproliferativen Glomerulonephritis [50]. Induziert 
wird diese Form der Glomerulonephritis durch eine intravenöse Injektion von 
Antikörpern, die gegen das Thy-1-Epitop von Mesangialzellen gerichtet sind.  
Diese führen zu einer dosis- und komplementabhängigen Lyse der 
Mesangialzellen. Andere Nierenzellen sind sekundär nicht betroffen, da in der 
Rattenniere nur dort das Thy-1-Epitop an der Zelloberfläche exprimiert ist. Die 
sich anschließende glomeruläre Reaktion gleicht dem Bild einer akuten 
mesangioproliferativen Glomerulonephritis mit Akkumulation von mesangialer 
Matrix und Hyperzellularität [51;52;53]. Im Rahmen dieser Erkrankung lassen 
sich folgende drei Phasen unterscheiden [10]: 
 
• Schädigungsphase: 
 
Komplementabhängige Lyse der Mesangialzellen und 
Makrophageninfiltration (maximale Ausprägung 6 bis 18 Stunden nach der 
Antikörperinjektion) 
• Matrixexpansionsphase: 
 Proliferation der Mesangialzellen, überschießende Matrixvermehrung und 
Mikroaneurysmen der glomerulären Kapillaren (ca. 3. bis 14. Tag nach der 
Antikörperinjektion) 
• Ausheilungsphase: 
Regression der glomerulären Veränderungen (ca. 14. Tag bis 6. Wochen 
nach der Antikörperinjektion) 
 
Die zeitliche Staffelung der Wundheilung macht es möglich, die einzelnen 
Phasen der Wundheilung spezifisch zu untersuchen. Die 
Blutdruckunabhängigkeit ist ein Vorteil dieses Modells. Die glomeruläre 
Schädigung ist immunvermittelt und während der Schädigungs- und 
Matrixexpansionsphase besteht kein erhöhter systemischer Blutdruck, so dass 
das Ausmaß der glomerulären Matrixvermehrung im wesentlichen der 

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Antikörper-induzierten Mesangialzellschädigung zugeschrieben wird.  
Dadurch ist dieses Modell besonders geeignet, blutdruckunabhägige Wirkungen 
auf die glomeruläre Matrixakkumulation zu untersuchen.  
1.4 Fragestellung 
Ziel der Arbeit war es, die nephroprotektiven Wirkungen der Aminosäure L-
Arginin für die chronisch progressive Matrixexpansion bei immun-vermittelter 
Glomerulonephritis im Hinblick auf ihren NO-Stoffwechsel weiter zu 
untersuchen. Es wurde die Arbeitshypothese  überprüft, ob die günstigen 
Wirkungen von L-Arginin auf die Überexpression des Zytokins TGF-ß in der 
normotensiven Anti-Thy-1-Glomerulonephritis der Ratte durch endogen 
produziertes NO vermittelt werden. Für diese Studie wurden folgende 
Versuchsansätze durchgeführt: 
 
I.  Therapie der Tiere mit einer diätetischen L-Arginin-Gabe  
II.  Therapie der Tiere mit dem NO-Donator Molsidomin  
III. Therapie der Tiere mit einer diätetischen L-Arginin-Gabe und 
zusätzlich einer niedrig dosierten Gabe des NO-Synthase-Inhibitors L-
Nitro-Arginine-Methyl–Esther (L-NAME).  
 
Die Behandlungen begann jeweils 24 Stunden nach Induktion der 
Glomerulonephritis  und wurde sieben Tage (Protokoll 1) bzw. zwölf Tage 
(Protokoll 2), bis zur Tötung der Tiere, fortgeführt. 
Nach Tötung der Tiere wurden histologische und molekulare Fibrosemarker 
analysiert. Hierzu wurde die glomeruläre Matrixakkumulation histologisch 
ausgewertet und die Expression von TGF-β als zentralem Fibrosemediator, 
Fibronektin als Marker für die Matixproduktion und PAI-1 als Marker für die 
Matrixdegeneration bestimmt. Darüber hinaus erfolgte die Analyse der NO-
Konzentration im Plasma und Urin-Spiegel als Zeichen der endogenen NO-
Produktion. Desweiteren wurde der systemische Blutdruck und die Proteinurie 
der Tiere bestimmt [35;54;55]. 

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Material und Methoden 
2.1 Materialien 
Alle verwendeten Materialien, Chemikalien, und Zellkulturmedien wurden, wenn 
nicht anders beschrieben, von der Firma Sigma (Taufkirchen, Deutschland) 
bezogen. 
2.2 Tierversuch 
Die Tierversuche und die damit verbundenen Experimente wurden von der 
Senatsverwaltung für Gesundheit und Soziales des Landes Berlin geprüft und 
genehmigt (Tierversuchsnummer G 0068/00). Alle Eingriffe an lebenden Tieren 
wurden unter Beachtung des § 9 Abs. 1 und 2 des Tierschutzgesetzes 
durchgeführt. Die Doktorandin arbeitete unter Aufsicht des Betreuers PD Dr. 
med. Harm Peters, qualifiziert für Eingriffe an lebenden Tieren gemäß dem § 9 
Abs. 1 des Tierschutzgesetzes [56]. Die anfallenden toten Tiere und 
Tierkörperteile wurden gemäß § 8 Abs. 1 und 2 des 
Tierkörperbeseitigungsgesetzes vorschriftsmäßig entsorgt [57]. 
2.2.1  Tiere und Tierhaltung 
Für die Tierversuche wurden 104 männliche Wistar Ratten der Firma „Charles 
River, Sulzfeld, Deutschland“ mit einem Gewicht von 200 bis 270 g verwendet. 
Die Haltung der Tiere erfolgte zu zweit in einem Käfig bei einem 12 Stunden 
Tag-/Nachtrhythmus in einem vollklimatisierten Raum. Futter- und Trinkmenge 
wurden täglich kontrolliert. 
2.2.2 Die Anti-Thy-1-Glomerulonephritis – Herstellung des Antikörpers 
OX-7 
Die Zellen der OX-7-Zellinie (Hybridoma Zellen der Firma Center of Applied 
Microbiology & Research, Saisbury UK) wurden bei –70°C gelagert und zum 
Ansatz einer Zellkultur zügig unter fließend warmen Wasser aufgetaut. Für die 
Erstkultivierung wurde zuvor folgendes Kulturmedium vorbereitet: RPMI 1640, 

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20 % fetales Kälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin. Das 
Kulturmedium wurde dann den Zellen zunächst tröpfchenweise zugegeben und 
auf 20 ml aufgefüllt. Der Ansatz wurde für 3 min bei 2500 U/min zentrifugiert, 
der Überstand verworfen und das Pellet in 15 ml Kulturmedium resuspendiert. 
Dieser Ansatz wurde dann in eine Kulturflasche überführt und bei 37°C und 5 % 
CO
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 inkubiert. Jeden zweiten Tag erfolgte eine mikroskopische Kontrolle mit 
Differenzierung von vitalen und abgestorbenen Zellen mittels einer Vitalfärbung 
mit Tryptan Blue. Ebenfalls erfolgte eine regelmäßige pH-Wert-Kontrolle. Die 
Zellen wurden alle zwei Tage passagiert und derartig vermehrt und separiert, 
dass nach einem Zeitraum von 14 Tagen 16 große Kulturflaschen (100 ml) 
vorlagen. Der Inhalt dieser Flaschen wurde dann in ein miniPERM-
Zellkulturgefäße (Heraeus-instruments, Hanau, Deutschland) überführt. Das 
Inseminationsvolumen lag bei 35 ml Zellsuspension mit einer Dichte von ca. 0,5 
x 10
6
 Zellen. Zur Optimierung der Antikörperproduktion wurde nach gutem 
Wachstum der Inhalt des ersten Kulturmoduls auf 4 Kulturmodule aufgeteilt, 
wobei die Dichte zu diesem Zeitpunkt im ersten Modul 8 x 10
6
 Zellen/ml betrug. 
Das sich im Versorgungsmodul der Einrichtung befindliche Medium wurde wie 
oben erwähnt zubereitet, zusätzlich aber noch mit 1,5 ml HEPES-Puffer 
supplementiert. Zur Gewährleistung einer optimalen Sauerstoffversorgung 
wurden die 4 Module auf Drehvorrichtungen gelegt, die sich im Brutschrank 
befanden. Der Mediumwechsel erfolgte während guter Wachstumsphasen der 
Zellen täglich. Das Abernten aus dem Versorgungsmodul erfolgte bei einer 
Zellzahl von 11,5 x 10
6
 Zellen/ml, wobei jeweils 17 ml aus dem 
Versorgungsmodul entnommen wurden. Das Volumen wurde mit Kulturmedium 
wieder aufgefüllt. Das erhaltene Gesamtvolumen an OX-7-haltigem 
Kulturüberstand betrug 327 ml. 
2.2.3  Aufreinigung des Kulturüberstandes 
Zur Trennung der Immunglobuline von Fremdeiweißen wurde der 
Zellkulturüberstand über eine HiTrap-Protein G-Säule (Amersham Pharmacia 
Biotech, Freiburg, Deutschland) geleitet. Hierbei wurden ein 20mM 
Sodiumphophat Binding Puffer (pH 7,0), ein 0,1M Glycine-HCl Elution Puffer 
(pH 2,7) und eine 1M Tris-HCl-Lösung (pH 9,0) zur Probenrekonstitution 

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