Mavzu: Ekspressiya va protoeomika bo`yicha ma`lumotlar bazasi reja: Kirish i-bob. Proteomika ma'lumotlarini qayta ishlash

1.3 Protein miqdorini aniqlash
Namunadagi butun proteomadagi oqsillarning ko'pligi miqdoriy proteomika tahlilidan olinishi mumkin. Miqdoriy proteomik ma'lumotlarning ortib borayotgan hajmi va ko'lami ko'plab keyingi bioinformatika tahlil usullarini ishlab chiqishga turtki bo'ldi. Hozirgi vaqtda namunalardan global oqsil ifodasi profillarini to'g'ridan- to'g'ri yaratish uchun standart tahlil liniyasi mavjud emas, chunki yuqori oqimga bag'ishlangan eksperimental texnikalar uchun ko'plab dasturiy ta'minot va algoritmlar ishlab chiqilgan. Shunga qaramay, ko'pgina eksperimental miqdorlarni aniqlash usullari ikkita toifaga bo'linadi : etiketli usullar va yorliqsiz usullar. Ushbu bo'limda biz birinchi navbatda ikkala texnika uchun mo'ljallangan eng so'nggi dasturiy vositalarni ko'rib chiqamiz, so'ngra klinik tadkikotlar uchun mass-spektrometriya deb ataladigan yangi texnikaga bag'ishlangan bir nechta dasturiy vositalarni taqdim etamiz. 2 -jadvalda ushbu bo'limda ko'rib chiqilgan protein miqdori miqdorini aniqlash uchun dasturiy vositalar ro'yxati keltirilgan .

Jadval 2. Miqdoriy proteomika uchun keng tarqalgan dastur paketi.

Hozirgi vaqtda yorliqlarga asoslangan miqdorni aniqlashning ikkita mashhur yondashuvi mavjud: MS1 (birinchi bosqich MS) asosidagi yorliqlash [88,89] va MS2 (ikkinchi bosqich MS) asosidagi markalash. MS1 asosidagi yorliqlashda turli namunalar markalanishiga qarab MS1 spektrlarida turli izotop naqshlariga ega bo'ladi. Bu in vitro va in vivo namunalar uchun ham amalga oshirilishi mumkin . Izotop kodli yaqinlik teglari (ICATs)

[90], dimetilga asoslangan etiketka [91] va izotop kodli oqsil yorlig'i (ICPL) [91] in vitro tajribalar uchun keng tarqalgan strategiyalardir . Hujayra madaniyatidagi aminokislotalar (SILAC) [92] va 15N metabolik yorliqlash
[93] tomonidan barqaror izotop belgilarini in vivo yorliqlash uchun eng mashhur strategiyalardir . Har xil bioinformatika MaxQuant [18], PVIEW [80] va XPRESS [81] kabi MS1 yorliqlash tajribalari uchun usullar ishlab chiqilgan . Ko'pgina dasturiy vositalar bir nechta yorliqlash usullaridan namunalarni boshqarishi mumkin. Misol uchun, XPRESS ICAT, SILAC va ICPL yorliqli namunalarni tahlil qila oladi, shuningdek, etiketli peptid juftlarining elyusiya profillari asosida oqsillarning nisbiy ko'pligini hisoblashi mumkin. PVIEW SILAC, ICPL va ICAT yorliqli namunalarni ishlay oladi va hatto chiziqli bo'lmagan hizalanishni yorliqsiz va yorliqsiz XIC asosidagi miqdorni ham amalga oshirishi mumkin.
Yorliqsiz miqdorni aniqlashda turli namunalar uchun spektrlar alohida LC-MS/MS tajribalaridan olinadi [ 99].
Biroq, bu istalmagan o'zgarishlarni keltirib chiqarishi mumkin, masalan , bir nechta tajribalardan olingan xromatografik o'lchovlarning nomuvofiqligi . Ushbu muammoni hal qilish uchun jami ionlar soni (TIC), MaxLFQ ( MaxQuantga integratsiyalashgan) kabi intensivlikni normallashtirishning turli usullari qo'llanildi [83]. Odatda, yorliqsiz miqdorni aniqlash parchalangan oqsillarning peptid prekursorlari ionlarining signal intensivligini tahlil qilish asosida amalga oshiriladi va ko'pgina dasturlar Mascot Distiller [100], MaxQuant [18] va VIPER [ kabi ushbu yondashuv yordamida ishlab chiqilgan. 84]. Bundan tashqari, tandem massa spektrlarini hisoblash muqobil miqdoriy yondashuv sifatida ishlatilishi mumkin. Mascot-ga integratsiyalangan eksponent ravishda o'zgartirilgan protein ko'pligi indeksi (emPAI) [82] bu yondashuvdan foydalanadigan vositalardan biridir .
Kuzatilgan peptidlar soni, shuningdek , mashinani o'rganish modellari yordamida xarakterli fizik-kimyoviy peptid xususiyatlariga asoslangan peptidlarni aniqlash ehtimoli bilan ham tuzatilishi mumkin [101].
IBAQ [102] va LCMSE [103] kabi modellar oqsillarning global mutlaq miqdorini o'lchash uchun yaratilgan . Masalan, iBAQ qiymatlari umumiy intensivlikni bitta protein uchun aniqlangan peptidlarga bo'lish natijasida hosil bo'ladi. Shunga qaramay, ionlanishning aniq samaradorligi va aniqlanishi tufayli turli xil oqsillarning ko'plik darajasini to'g'ridan-to'g'ri taqqoslash mumkin emas. Mutlaq mo'l-ko'llikni baholash sifatini yaxshilash uchun spike-in standartlari [104] yoki "proteomik o'lchagich" yondashuvi [105] qo'llanilishi mumkin .
Imaging massa spektrometriyasi (IMS) klinik tadqiqotlarda, xususan, nevrologiyada oqsil miqdorini aniqlashning mashhur usuli sifatida paydo bo'lmoqda [106]. IMS oqsillarning lokalizatsiya naqshlarini va ularning har xil turdagi hujayralar va biologik to'qimalarda ko'pligini tizimli ravishda aniqlash qobiliyatiga ega . IMSda turli biologik namunalardagi oqsillar turli zondlar bilan desorbsiyalanadi va ionlashtiriladi.
IMSda qo'llaniladigan mashhur usullar orasida lazer desorbsiyasi/ionizatsiyasi (LDI), matritsali yordamchi LDI (MALDI) [107], parvoz vaqti - ikkilamchi ion massa spektrometriyasi (TOF-SIMS) [108] va elektrospreyga asoslangan desorbsiya (DESI) kiradi. [109]. Ushbu texnikalar fazoviy o'lchamlari va aniqlash kuchining turli qobiliyatlari bilan bog'liq holda turli maqsadlar uchun mo'ljallangan. IMS-dan olingan xom tasvirlarning sifatini yaxshilash uchun tasvirni qayta ishlash algoritmlari, masalan, chekkadan saqlaydigan tasvirni denoising/ klasterlash [110] va fazoviy xabardor klasterlash [111] koÿproq maÿlumot beruvchi va aniq segmentatsiya xaritalarini yaratish uchun taklif qilingan . Integratsiyalashgan quvur liniyasida IMS ma'lumotlarini bazaviy tuzatishlar, ayirishlar, denozlash, tekislash, qayta kalibrlash va normallashtirishni amalga oshiradigan dasturiy ta'minot to'plamlari ham ishlab chiqilgan [112].
Proteomikada ma'lumotlarni tayyorlash va quyi oqim bioinformatika tahlili
Ma'lumotlarni oldindan qayta ishlash va normallashtirish
Peptidga asoslangan MS miqdorini aniqlashda oqsilning ko'pligi cheklangan miqdordagi peptidlardan, ba'zan esa faqat bittadan aniqlanadi. Odatda, tadqiqotchlar faqat oz sonli peptidlardan olingan xulosalarning ishonchliligini oshirish uchun minimal peptid raqamlari uchun kesishlarni ehtiyotkorlik bilan qo'llashlari kerak . Masalan, Peaks Studio Quantification protein miqdorini aniqlash uchun faqat eng yaxshi uchta peptiddan foydalanadi , shu bilan birga ular ishonchli tarzda aniqlansa, iloji boricha ko'proq foydalanishi kerak. Bundan tashqari, quyi oqim tahlili uchun taqqoslanadigan va ishonchli natijalarni yaratish uchun har doim xom miqdoriy ma'lumotlarni oldindan qayta ishlash va normallashtirishni amalga oshirish kerak .
Normalizatsiya biologik bo'lmagan har qanday o'zgarishlarni olib tashlaydigan va natijalarni ishonchli va quyi oqim tahlili uchun namunalar bo'ylab moslashtiradigan ma'lumotlarni tuzatish jarayonini anglatadi. Tegishli normalizatsiya usulini tanlash proteomik tahlilda juda muhim, ayniqsa LC/MS dan oldin etarli darajada normalizatsiya amalga oshirilmaganligini hisobga olgan holda [113]. Turli statistik taxminlar asosida bir necha turdagi normalizatsiya usullari ishlab chiqiladi. Protein ko'pligining taqsimlanishi ko'pincha nolga juda qiyshayib ketadi, shuning uchun keyingi normallashtirishdan oldin intensivlik qiymatlari bo'yicha logarifm transformatsiyasini amalga oshirish odatiy holdir. RlrMA va LinRegMA [114] kabi chiziqli regressiyaga asoslangan normalizatsiya uchun ular o'lchovlardagi noaniqlik va kuzatilgan protein ko'pligi shkalasi chiziqli bog'liq deb taxmin qilishadi.
Variantlarni barqarorlashtirishni normallashtirish (VSN) [116] yana bir statistik model bo'lib, u dispersiya va o'rtacha ko'plik o'rtasidagi bog'liqlikni bartaraf etishga va parametrik o'zgarishlar va maksimal ehtimollikni baholash orqali turli namunalardagi ma'lumotlarni bir darajaga o'tkazishga qaratilgan. Kvantil, median va EigenMS [117] normalizatsiyalari turli tadqiqotlarda proteomikada ham qo'llaniladi. Välikangas va boshqalar. [114] to'rtta alohida proteomik ma'lumotlar to'plamida o'n bitta tez-tez qo'llaniladigan normalizatsiya usullarini muntazam ravishda baholadi va natijalar shuni ko'rsatadiki, bu normalizatsiya usullari odatda proteomika ma'lumotlarining ko'pchiligida bir xil ishlash darajasiga ega , VSN esa odatda differentsial ifoda tahlilida doimiy ravishda yaxshi ishladi.
Ushbu bo'limda eslatib o'tilgan turli xil normalizatsiya usullariga qaramasdan, optimal normalizatsiya yondashuvi turli xil MS asosidagi proteomika tadqiqotlaridagi tajriba muhitiga bog'liq va MA uchastkalari bilan individual ravishda baholanishi kerak. Bundan tashqari, ierarxik klaster va issiqlik xaritalari oldindan ishlov berish bosqichlarining samaradorligini aniqlashga yordam beradigan foydali vizualizatsiya usullaridir.
Xom miqdoriy ma'lumotlar, ayniqsa, uyali kontekstda nisbatan past konsentratsiyaga ega bo'lganlar uchun etishmayotgan qiymatlarni o'z ichiga olishi mumkin. Eksperiment davomida namuna olishning stokastikligi tufayli etishmayotgan qiymatlar ko'pgina yuqori o'tkazuvchanlik texnologiyalarida keng tarqalgan [118]. Ushbu etishmayotgan qiymatlar aniqlangan barcha oqsillarni taqsimlash asosida olib tashlanishi yoki kiritilishi mumkin. Omik ma'lumotlar uchun etishmayotgan qiymatlarni hisoblash uchun turli xil mashina o'rganish modellari ishlab chiqilgan, jumladan empirik taqsimot namunasi [119], k-eng yaqin qo'shnilar (kNN) imputatsiyasi [120] va yagona qiymat dekompozitsiyasi (SVD) [121]. Biroq, ma'lumotlar ko'proq etishmayotgan qiymatlarni o'z ichiga olgan bo'lsa, ushbu hisoblash usullarining samaradorligi keskin pasayib ketishi
ko'rsatilgan [122]. Yangi etishmayotgan qiymat yondashuvlari yuqori hisoblash aniqligi va statistik sezgirlik bilan ishlab chiqilgan
Masalan, Wei va boshqalar. [123] MS ma'lumotlari uchun etishmayotgan qiymatlarni aniqlash uchun iterativ Gibbs namuna oluvchini moslashtiradigan GSimp-ni taklif qildi . Yaqinda Berg va boshqalar. [119] yuqori noto'g'ri musbat stavkalar darajasida yaxshiroq ishlashga ega oddiy taqsimotlardan namuna olishga asoslangan samarali hisoblash modelini ishlab chiqdi .