Synthetic Biology Final Report

Synthetic Biology | State of the Art

Yüklə 9,69 Kb.
Pdf görüntüsü
ölçüsü9,69 Kb.
1   ...   12   13   14   15   16   17   18   19   ...   49

Synthetic Biology | State of the Art 
codon optimisation - that is the creation of a sequence encoding the same protein, but avoiding rare codons. 
The  longevity  of  mRNA  transcripts  can  be  controlled  by  modifying  its  secondary  structure  in  untranslated 
regions that make it more or less vulnerable to RNases (Arpino et al. 2013).  
Similarly, protein degradation can be tuned by addition of degradation tags. For enzymatic activities, mutants 
with altered substrate specificity or thermostability can be created (Arpino et al. 2013). 
Random sequence variation in DNA units can be achieved by various techniques such as directed evolution via 
error-prone PCR (Arpino et al. 2013) or by synthesis with degenerate sequence (Ellis et al. 2009). The resulting 
libraries  of  diversified  parts  can  be  characterised  in  test  systems  and  versions  with  optimal  input-output 
characteristics and reaction rates can be selected for further applications. Mathematical modelling can greatly 
assist this process. For example, Ellis et al. (2009) created a library of promoters and a model describing their 
varying expression and inhibition thresholds. Based on this model the authors were able to produce devices 
with  quantitatively  predictable  behaviour.  For  RBS-optimisation  a  universal  and  popular  software  tool  is 
available:  The  RBS-calculator  (Salis  et  al.  2009)  reliably  predicts  ribosome  binding  strength  of  prokaryotic 
Shine-Dalgarno sequences. 
Copy number 
The  gene  copy  number  can  increase  or  decrease  the  expression  of  a  protein  over  a  partially  linear  range 
(Arpino  et  al.  2013).  Similarly,  multiplication  of  repressor  or  activator  binding  sites  has  been  shown  to 
influence gene expression in a predictable way (Xu et al. 2012).  
The  copy  number  of  plasmid-borne  genes  and  constructs  can  be  modified  easily  by  changing  the  origin  of 
replication  to  modify  the  plasmid  copy  number.  However  maintenance  of  increasing  numbers  of  plasmids 
adds  to  the  metabolic  burden  of  the  host  cell.  Alternatively  repetitive  tandem  copies  of  genes  or  control 
elements can be inserted into the same plasmid or chromosome (Arpino et al. 2013; Xu et al. 2012).  
Modularisation of genetic systems (MMME) 
Multigene pathways can be systematically improved by multivariate modular metabolic engineering (MMME). 
MMME groups genes with similar turnover into modules, i.e. into synthetic operons. Such groups of genes can 
be tuned in their expression as a single unit, using the toolbox of promoter and RBS strength, copy number 
etc.  This  simplifies  the  adjustment  of  multiple  genes  to  each  other  in  order  to  eliminate  bottlenecks  and 
maximise  pathway  turnover.  An  excellent  example  of  MMME  is  the  study  of  Ajikumar  et  al.  (2010),  who 
optimised a synthetic terpenoid pathway for the synthesis of the taxol-precursor taxadiene in Escherichia coli 
(Figure 9). Ten genes of bacterial and plant origin were arranged in two modules that could be harmonised in 
their  expression  levels.  Using  this  approach,  the  authors  needed  to  construct  only  32  strains  to  identify  a 
variant with 15000-fold increased taxadiene production, whereas varying and combinatorial screening of the 
ten  individual  genes  would  have  required  construction  of  10  000  strains.  Modular  plasmid  backbones  that 
enable parallel generation of differently configured pathway variants within a few cycles of cloning facilitate 
MMME (Xu et al. 2012). 

Synthetic Biology | State of the Art 
Figure 9: Modularisation of a taxadiene biosynthesis pathway. Detail from a figure of Ajikumar et al. (2010) 
Simultaneous modification and combinatorial screening of multiple genes (MAGE) 
More frequently than not, several genes need to be modified simultaneously to obtain a superior phenotype. 
The  recently  developed  multiplex-automated  genomic  engineering  (MAGE)  protocol  produces  genomic 
diversity by simultaneously modifying several genomic locations on the chromosome of a single cell or across a 
cells population (Yadav et al. 2012). The capabilities of MAGE have been demonstrated in a study of Wang et 
al.  (2009)  who  targeted  all  20  genes  involved  in  the  terpenoid  pathway  of  Escherichia  coli  to  modify 
biosynthesis  of the  tetraterpene  pigment  lycopene. Significant  improvements were made  within  short  time. 
However,  combinatorial  screening  of  20  genes  required  testing  of  100000  mutants.  MAGE  is  therefore 
restricted  to  end-products  with  colorimetric  properties  or  other  properties  that  can  be  assessed  in  high 
throughput screenings (Yadav et al. 2012). 
Metabolic flux analysis 
Empowered by the volume of gene, protein and metabolite data accumulated in biotechnology databases the 
focus  of  metabolic  engineering  has  shifted  from  perturbing  individual  pathways  towards  manipulating  the 
entire  cell  for  optimised  product  formation.  The  target  pathway  is  considered  in  the  context  of  the  entire 
metabolic network of the host cell. This enables handling competition with native pathways, accumulation of 
inhibitory side products and other interaction phenomena (Yadav et al. 2012). 
Flux balance analysis (FBA) is a popular simulation tool for integrative metabolic engineering of well described 
organisms,  such  as  Escherichia  coli.  FBA  describes  the  network  of  a  cell's  metabolic  reactions  in  a 
stoichiometric matrix.  Stoichiometric  information  is  retrieved  from  experimental  biochemical  data  and  from 
comparative  analysis  of  enzyme  coding  genes  of  different  completely  sequenced  organisms.  Based  on  this 
matrix,  FBA  predicts  metabolic  fluxes,  i.e.  turnover  rates  of  metabolites,  and  helps  to  maximise  desired 
functions  (Comba et  al. 2012; Bilgin and Wagner 2012). For example  Xu et  al. (2011)  used FBA to identify a 
minimum set of genetic interventions required to redirect the carbon flux in Escherichia coli towards malonyl-
CoA building blocks for flavonoid synthesis. 
For  dynamic  regulation  of  metabolic  fluxes,  regulatory  devices  can  be  employed  to  sense  accumulation  of 
metabolites and subsequently up-regulate reactions that redirect fluxes towards the intended output (Zhang 
et al. 2012). 
Metabolic network analysis can also be used to predict the minimum metabolic requirements for a cell under 
given  conditions.  Applying  FBA  to  sets  of  random  networks  that  were  automatically  generated  from 
biochemical  reaction  databases,  Bilgin  and  Wagner  (2012)  calculated  that  a  cell  synthesizing  20  biomass 
molecules from 20 alternative carbon sources requires a minimum of 260 reactions. Every additional carbon 
source requires two extra reactions; every additional product requires three extra reactions, on average. 

Yüklə 9,69 Kb.

Dostları ilə paylaş:
1   ...   12   13   14   15   16   17   18   19   ...   49

Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur © 2024
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə