Synthetic Biology Final Report

Synthetic Biology | State of the Art 
 
27 
 
Figure 4: Overview of exemplar DNA assembly techniques (from Ellis et al. (2011)) 
Genes to pathways (linking genes to construct pathways and devices) 
The  challenge  of  assembly  at  larger  scales  has  led  to  methods  utilising  Type  II  restriction  enzymes  like  the 
Golden  Gate  assembly  method:  a  parallel  one-pot,  one-step  five  min  technique  to  assemble  seamless 
constructs. DNA is inserted into an entry clone shuttle vector which provides the Type II recognition sequences 
immediately at both ends of the DNA pieces. Digestion then produces  all the fragments for assembly  which 
ligate  in  parallel  where  overhangs  are  complementary.  This  method  is  also  suitable  to  shuffle  multiple 
fragments. 
Forbidden  site  requirement  may  occur  –  this  problem  can  be  solved  with  the  oligo-based  technology  RARE 
(RecA-assisted restriction endonuclease), whereby sequence-specific blocking oligos prevent CpG methylation 
of tag digest sites, via RecA-mediated binding to homologous sequences (Ferrin and Camerini-Otero 1991). 

---

Synthetic Biology | State of the Art 
 
28 
Overlap  assembly methods: These  methods  require DNA  fragments  for  assembly  to  share  at  least 20  bp  of 
common sequence at ends that will be joined. This sequence is processed in vitro by enzymes that perform the 
assembly.  Several  kits  are  available  on  the  market,  such  as  Gateway®  (Life  Technologies)  and  InFusion® 
(Clontech).  Suited  particularly  for  parallel  reactions  with  several  DNA  fragments,  these  techniques  are  also 
often called “chew back and anneal”. They work by digesting back one strand of DNA from each exposed end 
of  a  fragment,  leaving  a  single-stranded  overhang  that  anneals  with  the  complementary  overhang  of  a 
fragment sharing the same overlap sequence. The order of the fragments is pre-determined by the sequence 
overlap between them. 
USER  cloning  and  USER  fusion  (uracil-specific  excision  reagent)  is  a  cloning  technique  which  requires  a  PCR 
amplification  of  fragments  using  primers  that  incorporate  at  least  one  uracil.  No  assembly  scars  are  left 
behind, seamless assembly is possible. The drawback of this method is that at least one thymidine is required 
near the end of the sequence (replaced with uracil), so it is not truly sequence-independent. 
Several  other  ligation-independent  cloning  methods  also  exist  and  a  sequence-independent  variation  SLIC 
(sequence- and ligation-independent cloning) has recently been described (Ellis et al. 2011). The Craig Venter 
Institute  published  several  overlap  methods  where  whole  genomes  were  assembled  in  vitro  from  directly 
synthesised  five  kb  fragments  designed  to  have  a  more  than  100  bp  overlapping  sequence.  The  Gibson 
isothermal assembly method requires a high fidelity DNA polymerase, T5 exonuclease and Taq DNA ligase and 
foresees a single 30 min-incubation at one temperature.  
Zhang et al. (2012) describe how to assemble multiple DNA fragments into recombinant DNA molecules in a 
single  in  vitro  recombination  reaction  (SLiCE  –  Seamless  Ligation  Cloning  Extract).  This  method  is  based  on 
bacterial extracts from common RecA
-  
Escherichia coli laboratory strains, which can also be further optimised 
by simple genetic modifications, and does not leave any unwanted sequences at the junction sites. SLiCE is also 
capable  of  facilitating  recombination  between  DNA  fragments  that  contain  flanking  heterologous sequences 
and of deleting the extra flanking sequences to generate precise junctions at the recombination sites. 
Pathways to genomes 
At this level parallel assembly reactions are essential; the order of assembly has to be defined.  
TAR (Transformation Assisted Recombination cloning) is a common protocol for manipulation of DNA in yeast. 
It undergoes homologous recombination during yeast spheroplast transformation and is predominantly used 
to incorporate gene- and pathway-sized DNA assemblies into specific sites in the yeast genome. By including a 
yeast  artificial  chromosome  (YAC)  replication  sequence  and  a  selective  marker  in  one  assembly  fragment, 
assembly of a circular self-propagations construct is achieved. The native recombination enzymes of yeast are 
working, so the assembly in yeast is very accurate and it tolerates very large constructs.  
For genome sized assembly, yeast is not the only cellular chassis; also Bacillus was used by Itaya et al. (2008). 
Gibson  et  al.  (2010)  reported  the  design,  synthesis  and  assembly  of    the  1.08-mega-base  pair  Mycoplasma 
mycoides  JCVI-syn1.0  genome  starting  from  digitised  genome  sequence  information  and  its  transplantation 
into a Mycoplasma capricolum recipient cell to create new Mycoplasma mycoides cells that are controlled only 
by the synthetic chromosome. 
With a combination of in vitro enzymatic methods and in vivo recombination in Saccharomyces cerevisiae the 
synthetic genome from Mycoplasma genitalium was assembled in four stages out of an initial DNA cassette of 
about 6 kb in size. 

---

Synthetic Biology | State of the Art 
 
29 
Bacterial genomes grown in yeast (eukaryotes) are unmethylated and thus are not protected from the single 
restriction system of the recipient cell (prokaryotes dispose of a restriction system). This restriction barrier can 
be  overcome  by  methylating  the  donor  DNA  with  purified  methylases  or  crude  Mycoplasma  mycoides  or 
Mycoplasma capricolum extracts, or by simply disrupting the recipient cell’s restriction system. 
Design of the Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 genomes was based on the highly accurate finished genome 
sequences of the laboratory strains of Mycoplasma mycoides subspecies capri GM12. 4. Watermark sequences 
were designed to further differentiate between the synthetic genome and the natural one. These watermark 
sequences encode unique identifiers while limiting their translation into peptides. The oligonucleotides used in 
the cassettes were synthesised by Blue Horn (Bothell, Washington). The genome assembly was performed in 
three stages: In the first step, 1080 bp cassettes (orange arrows) were recombined in sets of 10 to produce 109 
~10 kb assemblies (blue arrows). These were then recombined in sets of 10 to produce 11 ~100 kb assemblies 
(green arrows). In the final stage of assembly, these 11 fragments were recombined into the complete genome 
(red  circle).  With  the  exception  of  two  constructs  that  were  enzymatically  pieced  together  in  vitro  (white 
arrows), assemblies were carried out by in vivo homologous recombination in yeast.  
 
Figure 5: The assembly of a Mycoplasma mycoides genome in yeast (Gibson et al. 2010) 

---