Synthetic Biology Final Report

Synthetic Biology | State of the Art 
 
18 
3
 
State of the Art 
3.1
 
Overview of paths to synthetic life 
3.1.1
 
Top-down or bottom-up 
The  behaviour  of  synthetic  biology  parts  within  a  particular  host  has  to  be  defined  to  render  it  repeatable 
(Kitney and Freemont 2012). Numerous genes are involved in cellular communication while others have been 
shown  to  be  non-essential  to  cell  functioning.  It  was  early  suggested  that  it  would  be  possible  to  reduce 
genome  complexity  to  a  minimal  set  of  genes  able  to  sustain  (under  given  external  conditions)  cell  life  and 
reproduction.  This  idea  is  exploited  in  the  so-called  top-down  approach.  The  bottom-up  approach  starts 
constructing  a  synthetic  cell  from  scratch:  a  life-like  entity  is  built  by  assembling  of  molecular  components. 
These  can  be  of  biological  nature  or  instead  completely  ad  hoc  chemical  components.  Between  these  two 
approaches  is  the  concept  of  xenobiology,  which  aims  at  the  construction  of  functional  alternative  nucleic 
acids (Porcar and Pereto 2012). 
The  top-down  approach  aims  at  simplifying  already  reduced  cells  to  get  a  “chassis”  for  synthetic  biology 
devices  to  be  mounted  on  and  has  been  tried  in  bacteria  and  yeast.  Non-essential  genes  –  commonly 
responsible  for  adaptation  to  stress  or  altered  environmental  conditions  –  are  removed,  as  are  intergenic 
regions. Prerequisite is a thorough analysis of suitable regions, usually by employing mutants.  
For  the  bottom-up-approach  the  whole  minimal  sequence  is  compiled  from  scratch,  synthesised  and 
transferred into a suitable cellular casing. After pioneering work in 2007, the approach has been successfully 
used  in  Mycoplasma  genitalium  and  Mycoplasma  mycoides/Mycoplasma  capricolum  (Lartigue  et  al.  2007; 
Gibson et al. 2008; Gibson et al. 2010). Three major research endeavours may be  identified:  the large  scale 
synthesis of microbial genomes, the redesign of metabolic pathways (production of desirable compounds), and 
the rational design of genetic logic devices from modular DNA parts (Agapakis et al. 2012). 
3.1.2
 
Prerequisites 
Techniques to assemble synthetic genomes 
DNA synthesis technologies allow creating entire genomes. In synthetic biology, custom-made DNA is used to 
build larger DNA segments, and groups of these fragments are pieced together into larger fragments that are 
assembled  until  the  desired  DNA  product  is  obtained  (Montague  et  al.  2012).  There  are  ligation  dependent 
methods,  like  BioBrick™  and  Golden  Gate,  and  overlap  dependent  methods  to  assemble  overlapping 
fragments  (see  Patron  (2014)  for  a  review).  Two  of  the  most  commonly  used  methods  are  BioBricks™  (or 
standard  assembly)  and  Gibson  Assembly®,  complemented  by other  systems  like  GoldenBraid,  which makes 
use  of  GBparts  (fragments  of  DNA  with  four-nucleotide  overhangs)  as  minimal  standard  building  blocks 
(Gibson et al. 2009; Kitney and Freemont 2012; Sarrion-Perdigones et al. 2013). GoldenBraid has been shown 
to serve as a modular assembly system in plant synthetic biology (Sarrion-Perdigones et al. 2014). Depending 
on the size, a range of methods is available, including inter alia BglBricks, CPEC (Circular Polymerase Extension 
Cloning),  Golden  Gate,  and  for  larger  assemblies  sequence-independent  overlap  methods  such  as  SLIC 
(Sequence-  and  Ligation-Independent  Cloning),  InFusion™,  Clontech™,  Gibson  Assembly®,  SLiCE  (Seamless 
Ligation  Cloning  Extract),  and  CPEC  USER  (Uracil-specific  excision  reagent  cloning).  So  far,  in  particular  TAR 
(Transformation-Associated Recombination in Saccharomyces cerevisiae) and Gibson Assembly® have proved 
successful.  In  contrast  to  the  building  of  new  genomes  by  DNA  synthesis  and  assembly,  alternatively 
distributed recombineering methods such as MAGE/CAGE and TRMR in  Escherichia coli or Green Monster in 

---

Synthetic Biology | State of the Art 
 
19 
Saccharomyces cerevisiae are used. To date, these methods are limited to a narrow set of organisms so that a 
number of metabolic and biological tools may therefore not be worked on (Montague et al. 2012). 
Standardisation 
Standardisation  is  necessary  to  accurately  reproduce  synthetic  biology  devices  and  systems.  However, 
concomitantly  the  full  characterisation of  parts  is  necessary,  which  has  currently  not  yet  been  reached  to a 
sufficient extent. Parts usually need to be characterised in a specific genetic or environmental context and do 
not  function in a  predictable manner when taken out  of this context. Thus, it will be  necessary to solve the 
issues  of  parts  characterisation  and  interoperability  by  increasing  the  scope  and  diversity  of  tested  designs 
(Cameron et al. 2014). 
Registry of parts 
To  make  use  of  parts  efficiently,  the  need  for  a  professional  registry  of  parts  was  identified  (Kitney  and 
Freemont 2012). The registry comprises a database and should include the full characterisation of parts in the 
context  of  suitable  hosts.  To  tackle  the  storage  and  assembly  of  genetic  parts,  the  Registry  of  Standard 
Biological  Parts  (RSBP)  was  established,  which  facilitates  the  methodological  assembly  of  parts  into  larger 
circuits by storing them in the standardised “BioBrick™” format. A standard computational language (Synthetic 
Biology  Open  Language,  SBOL)  was  subsequently  developed  to  describe  parts  and  designs,  and  to  facilitate 
their exchange. 
Chassis and minimal genomes 
A  core  undertaking  in  synthetic  biology  is  the  “minimal  genome”  concept,  i.e.  the  minimal  set  of  genes 
required to allow cellular life, onto which genes can be added and then transplanted into a chassis (Acevedo-
Rocha et al. 2013). The minimal genome contains the simplest possible components to sustain reproduction, 
self-maintenance and evolution (Sole et al. 2007; CBD 2014). To develop a core or minimal chassis the genome 
is reduced to a functionally useful set of genes. The result should be a simple, predictable and programmable 
chassis  that  is  able  to  propagate  in  a  safe  and  controllable  manner,  including  mechanisms  preventing 
unintended release into the environment and ensuring isolation from other organisms. The minimal genome 
allows  avoiding  potential  risks  by,  e.g.,  minimising  the  potential  of  cells  to  propagate  under  natural 
environmental conditions and excluding pathogenicity. The aim is to generate simple cellular systems, which 
may be used to answer scientific questions concerning the systematic interplay of cellular modules (Esvelt and 
Wang 2013).  
A chassis derives from a well-known, safe platform cell factory, involving the reconstruction of a completely 
synthetic pathway and the alteration of metabolic fluxes (Nielsen and Keasling 2011). In industrial production a 
few  fungal  and  bacterial  cell  factories  are  used,  e.g.  Saccharomyces  cerevisiae  for  the  production  of  fuels, 
Escherichia coli  for producing pharmaceuticals, or  Corynebacterium  glutamicum  for the production of amino 
acids. Escherichia coli, for example, is an ideal test bed for synthetic biology endeavours because of the already 
established deep mechanistic understanding of its biology, its ease of genetic manipulation and the relatively 
large number of well-studied gene regulatory systems (Cameron et al. 2014). 
3.1.3
 
Platform cell factories 
Synthetic  biology  and  metabolic  engineering  interact  to  turn  living  cells  into  microbial  factories  used  in 
industrial biology (“self-regenerating machines”) (Nielsen and Keasling 2011; Agapakis et al. 2012). The aim is 
to have a limited number of “platform cell factories” available to produce a wide range of fuels and chemicals. 
A major advantage of such platform is that it may  be  used to insert many different  synthetic pathways. For 
example, a platform cell factory may be created such that it produces an important precursor metabolite for 
many  products,  e.g.  acetyl  Co-A  for  the  production  of  polyketides  (antibiotics,  anticancer  drugs  and 

---