Synthetic Biology Final Report

Synthetic Biology | State of the Art 
 
24 
DNA  bases  at  specific  sequences.  Another  restriction  enzyme  labels  the  bacterium’s  DNA  as  self,  and  so  it 
distinguishes self from foreign DNA that would enter the cell during a bacteriophage infection” (Glass 2012). 
Yeast  does  not  have  this  system.  The  bacterial  restriction-modification  genes  are  not  expressed  while  the 
genome is cloned in yeast. Any bacterial genome that is isolated from a yeast cell will not have the specific 
methylation needed to keep the recipient cell restriction modification system from recognizing it as foreign 
DNA  and  cutting  it  to  pieces.  Glass  and  coworkers  managed  to  mutate  the  Mycoplasma  capricolum 
restriction  enzyme  so  that  it  could  no  longer  cut  donor  genomes  lacking  the  appropriate  methylation. 
Obviously  there  were  no  differences,  other  than  the  restriction-modification  systems  issues,  between 
eukaryotic and prokaryotic DNA that would interfere with the genome transplantation process (Glass 2012). 
-
 
Yeast 
The yeast species which is mainly used as a chassis in synthetic biology is Saccharomyces cerevisiae. It is largely 
used in molecular biology, particularly in relation to research on the eukaryotic cell, which links directly into 
human biology. They appear to be able to accommodate larger sequences of modified DNA than  Escherichia 
coli. The eukaryotic microbe has remarkable capacity to combine homologous pieces of DNA, allowing for up 
to 200 base pair overlaps between synthetic fragments (Glass 2012). 
Cell engineering 
This approach pursues the synthesis of minimal but complete genomes and their insertion in cells to redesign 
and control metabolic processes (Moya et al. 2009). 
According  to  the  kind  of  modification  and  the  genetic  level  where  the  modification  takes  place  Ellis  et  al. 
(2011) categorised three issues: 
1.
 
Parts to genes 
2.
 
Genes to pathways 
3.
 
Pathways to genomes 
Roughly, these steps comprise combining parts to produce genes, linking genes to make pathways and devices, 
and finally arranging these together to create synthetic chromosomes and genomes. 
 
Table 1: Possibilities for DNA assembly in synthetic biology (Ellis et al. 2011) 
The DNA assembly process is still a limiting factor for most laboratories. The methods differ in mechanism and 
scale, offering the self-assembly of many parts in a single reaction (parallel assembly), giving constructs with a 

---

Synthetic Biology | State of the Art 
 
25 
pre-defined  physical  arrangement  (ordered  assembly),  or  allowing  multiple  versions  of  parts  to  be  used 
simultaneously  (combinatorial  assembly).  The  challenge  for  synthetic  biology  is  to  develop  standardised 
assembly methods allowing work at all levels of abstraction – genes, pathways and genomes – and to clearly 
understand the context dependencies when parts are physically placed next to other parts (Ellis et al. 2011). 
Assembly of a gene from its individual parts functionally requires ordered assembly. Scar-sequences – bases 
without  function  left  behind  by  some  assembly  methods  –  are  undesirable  as  they  often  affect  how  parts 
function together, and individual parts possibly cannot be replaced in another way once assembled (Ellis et al. 
2011). 
An  idealised  assembly  method  should  be  suitable  for  combinatorial  construction  from  standardised  part 
libraries,  have  no  forbidden  site  requirements,  and  allow  for  pre-determined  order  in  the  final  product.  It 
should also allow rapid assembly in a parallel reaction, working at any scale and only leave scars between parts 
that can tolerate them.  As currently no single technique is capable to fulfil all these requirements the most 
appropriate strategy involves using several techniques in tandem (Ellis et al. 2011). 
Genome synthesis 
Genome synthesis, i.e. DNA synthesis of entire genomes, entails chemically synthesising DNA molecules from 
the  four different DNA nucleotides or bases: Adenine,  Guanine, Thymine  and Cytidine. These four bases are 
chemically  synthesised  from  glucose  and  are  linearly  assembled  in  specific  sequences  using  an  instrument 
called an oligonucleotide synthesiser (Glass 2012). 
 
Figure 2: Strategy for synthesising the genome of Mycoplasma genitalium (Glass 2012) 

---

Synthetic Biology | State of the Art 
 
26 
Genome transplantation 
Is the process of installing a naked bacterial chromosome into a suitable recipient cell in such a way that the 
installed genome  commands and reprograms the machinery of the recipient  cell. The resulting cell has only 
the attributes encoded by the new genome (Glass 2012).  
 
Figure 3: Strategy for making a synthetic bacterial cell (from Glass (2012)) 
Parts to genes 
Current techniques employ standardised restriction enzyme assembly protocols such as BioBricks™, BglBricks 
and Golden Gate methods. Alternatively, sequence independent overlap techniques, such as InFusion™, SLIC 
and Gibson assembly® (an isothermal assembly) are becoming popular for larger assemblies, and in vivo DNA 
assembly in yeast and bacillus appears adept for chromosome fabrication (Ellis et al. 2011). 
BioBrick™: a DNA unit with standardised flanking sequences that enables assembly to be achieved by a cheap, 
simple  and  standardised  restriction/ligation method.  The  major  downside  of  the  BioBrick™  approach  is that 
the same eight bp scar sequence is found at every junction. The presence of this scar sequence is unacceptable 
at  certain positions, notably  the  RBS (Ribosome  Binding Site). The  scar is also problematic when assembling 
fusion proteins as it encodes an in-frame stop codon. 
Another  standard,  BglBricks  has  been  described  that  uses  different  sequences  for  assembly  and  leaves  a 
smaller  six  bp  scar.  BglBrick  has  the  advantage  of  using  highly  efficient  and  commonly-used  restriction 
enzymes whose recognition sequences are not blocked by the most common DNA methylases, Dam and Dcm.  
Scarless  assembly  is  possible  using  other  methods,  as  described  in  OE-PCR  (overlap  extension  polymerase 
chain reaction). This method uses chimeric PCR primers of more than 40 bases in length to create homologous 
ends between different DNA molecules. The homology is then used to prime extension in a second round of 
PCR between the initial products, and is the basis of most routine gene fusion techniques. The sequences of 
the homologous primers direct which parts follow each other, allowing ordered assembly which can be done 
sequentially, or even as a parallel reaction. OE-PCR has the power to assemble not just a gene, but the whole 
plasmid (CPEC – circular polymerase extension cloning). Like all PCR methods, assembly is problematic when 
sequences  contain  many  repeats  or  are  GC-rich.  These  methods  are  also  limited  in  their  ability  to  scale  up, 
plasmids becoming less efficient at larger sizes and by the error rate of PCR. 

---