T. C. Tarim ve köYİŞleri bakanliği koruma ve Kontrol Genel Müdürlüğü avian influenza(tavuk vebasi) acil eylem plani

EK 6

• 
  Haberleşme araçları (Telefon, faks)
  
• 
  Ulaşım araçları.
  
• 
  Bilgisayar, yazıcı ve gerekli bilgisayar yazılım programları.
  

• Bina bitişiğinde taşıt araçları için gerekli park yerleri.

• Herhangi bir AI salgınında temas kurulması gerekebilecek bütün yerel canlı hayvan kuruluşlarının temas numaralarının listeleri.

• Acil durumda çağrılabilecek personelin listesi .

• Personelin, giyeceklerin ve taşıtların temizlik ve dezenfeksiyonu için imkanlar.

• Koruyucu giysiler.

• AI’ye karşı etkili dezenfektanlar, deterjanlar ve sabunlar.

• Kesim ekipmanı-trankilizan (sakinleştirici) ilaçlara da ihtiyaç duyulabilir.

• Otopsi ve numune alma ekipmanı.

• Enfekte alanların çevresinde kullanılmak için gerekli, üzerinde uyarı yazıları bulunan işaret direkleri,

• Aşılama ekipmanı.

• Büro ekipmanı.

• Hastalık çıkışını araştırma formları.

• İzleme talep ve raporları (kontrol listeleri).

• Hareket izinleri.

• İlave taşıtlar.

• Yanıcı maddeler.

• Alev tabancaları.

EK 7
Örneklerin toplanması ve işlenmesi
Örnekler: AI şüphesi durumunda aşağıda belirtilen patolojik örnekler alınmalı ve laboratuara gönderilmelidir.

• 
  En az 5 adet ölmek üzere kanatlı (post mortem muayene için) veya,
  
• 
  En az 5 adet ölmek üzere kanatlıdan toplu trakeal ve akciğer numuneleri veya,
  
• 
  En az 5 adet ölmek üzere kanatlıdan toplu bağırsak numuneler ,
  
• 
  Sağlıklı kanatlılardan kloakal ve trakeal svablar (30 kanatlı örneğinden az olmamalıdır) (ayrıca su kuşlarından ve uçamayan kuşlardan da),
  
• 
  Sürü büyüklüğü 20’den daha az ise bütün kanatlılardan kan örnekleri alınır. Daha büyük sürülerden ise 20 kan örneği alınır (Böylece sürü büyüklüğüne bağlı olmaksızın sürünün %25 ya da daha fazlasının pozitif olması durumunda %99 olasılıkla en az bir pozitif serumun yakalanması mümkün olur). Kan pıhtılaşmaya bırakılmalı ve test için serumu alınmalıdır.
  

Farklı organlardan numuneler bir arada aynı havuza alınmamalıdır. Enfeksiyon etkeninin yayılmasını önlemek için uygun şekilde paketlenmeli, ambalajlanmalı (sızdırmaz kaplar, en az iki plastik çanta ile sarılmış olarak), ve laboratuara soğutulmuş şartlarda ulaştırılmalıdır. Kesilmiş hayvanlar izole edilmiş otoklav edilebilen plastik çantalarda taşınmalı ve benzer ikinci bir çantaya konmalıdır. Bütün numuneler laboratuara içinde buz kutuları bulunan bir polisitren kutu içerisinde ulaştırılmalıdır. Polisitren kutunun enfekte mekanlardan çıkışı öncesi uygun şekilde dezenfekte dilmiş olması gerekmektedir. Numunelerle birlikte uygun numune formları da mevcut olmalıdır.
Numunelerin ulaştırılmasından sorumlu sürücü hiç bir yerde durmadan doğruca laboratuara gitmelidir.
Örneklerin işlenmesi: Organ ve dokular bir havuzda toplanabilir, ancak dışkı materyalinin ayrı olarak işlenmesi zorunludur. Svablar yeterli antibiyotik bulunan ortamda muhafaza edilmeli ve ortama tam olarak batırılmaları sağlanmalıdır. Dışkı örnekleri ve organlar antibiyotikli ortamda homojenize edilmelidir (kapalı bir karıştırıcı, blender, ya da steril kum kullanılarak havan içinde) ve ortamın %10-20’lik w/v (ağırlık/hacim) süspansiyonu yapılmalıdır. Süspansiyonlar ortam sıcaklığında yaklaşık iki saat bekletilmelidir (ya da 4⁰C’de daha uzun süre) ve daha sonra santrifüj yolu ile berraklaştırılır (örneğin 800 - 1000 x g (devir) 10 dakika).
Antibiyotik vasatı: Dışkı örneklerinde yüksek antibiyotik konsantrasyonlarına ihtiyaç vardır, tipik bir karışım şöyledir: Fosfat buffer salin (PBS) içinde 10 000 ünite/ml penisilin, 10 mg/ml streptomisin, 0,25 mg/ml gentamisin ve 5 000 unite/ml mikostatin. Bu oranlar organlar ve dokular için beş katına kadar indirilebilir. Chlamydia organizmlerinin kontrolü için 50 mg/ml oksitetrasiklin ilave edilebilir. Vasat hazırlarken pH’nın kontrol edilerek antibiyotik ilavesi sonrasında pH’nın pH 7.0 – 7.4’e ayarlanması gerekir.

EK 8

Etkenin izolasyonu ve tanımlanması
Virüsün embriyolu tavuk yumurtasında izolasyonu: Berraklaştırılan süpernatan sıvı 0.1 – 0.2 ml miktarında 9-11 gün inkübe edilmiş en az beş adet embriyolu tavuk yumurtasının allantoik boşluğuna inoküle edilir. İdeali bu yumurtaların SPF sürüsünden temin edilmesidir, ya da en azından spesifik antikor negatif sürülerden olmalıdır. İnoküle edilen yumurtalar 37 ⁰C’de tutulurlar ve günlük işıkta kontrol edilirler. İnokülasyondan 7 gün sonra ölü yumurtalar ya da ölmekte olan embriyolar ve kalan tüm yumurtalar +4 ⁰C’ye soğutulurlar ve allantoik-amniyotik sıvılar HA aktivitesi yönünden test edilirler. HA tespit edildiğinde bakterilerin varlığı kültür yolu ile dışlanmalıdır. Eğer bakteriler varsa sıvıların 450 nm membran filtreden geçirilmesi gerekir, tekrar ilave antibiyotikler eklenir ve yukarıda belirtildiği şekilde embriyolu yumurtaya inoküle edilir. HA aktivitesi tespiti Influenza A virüsünün ya da bir avian paramiksovirüsün yüksek ihtimalle varlığına işaret eder. Negatif reaksiyon veren sıvıların en az bir parti yumurtaya daha geçişlerinin yapılması gerekir.
İnfluenza A virüsünün varlığı, influenza A virusları için ortak olan nükleokapsit ya da matriks antijenlerinin varlığı sergilenmek suretiyle agar jel immünodifüzyon (AGID) testlerde göterilebili. Enfektif allantoik sıvıdan virüsün konsantrasyonu ya da enfekte koriyoallantoik membranlardan virüs ekstrakte edilerek antijen hazırlanabilir; bunlar bilinen pozitif antiserumlarla test edilirler. Virüs enfektif allantoik sıvıdan ultrasantrij yolu ile ya da asit ortam altında presipitasyon yolu ile konsantre edilebilir. Belirtilen ikinci metotta enfektif allantoik sıvıya yaklaşık pH 4.0 olana kadar 1.0 M HCl ilave edilir. Karışım 1 saat süre ile buz banyosuna konur, sonra + 4 ⁰C’de 1000 g’de santrifüj yolu ile berraklaştırılır. Süpernatan sıvı atılır. Virüs konsantresi glisin- sarkosil tampon’da yeniden süspanse edilir: bunda 0.5 M glisin ile pH 9.0’a tamponlanan %1 (w/v) sodyum lauril sarkosinat bulunur. Bu konsantreler hem nükleokapsit hem de matriks polipeptitleri içerirler.
Nükleokapsit yönünden zengin antijen preparatları AGID testinde kullanılmak üzere koriyoallantoik membrandan da elde edilebilir.
Enfekte yumurtalardan alınan koriyoallantoik membranlardan nükleokapsit yönünden zengin antijenlerin hazırlanması; Bu metot HA aktivitesine sahip allantoik sıvı içeren yumurtalardan koriyoallantoik membranların çıkarılması ile ilgilidir. Membranlar daha sonra homojenize edilir, ezme şekline gelecek şekilde dövülür.
Bu, üç kez dondurma ve eritme siklusuna tabi tutulur, bunu 1 000 g’de 10 dakika süre ile santrifüj izler. Pellet atılır. Süpernatan %0.1 formalin ile işlem gördükten sonra antijen olarak kullanılır.
Bu iki antijenden birisi immünodoubledifüzyon testlerinde %1 agaroz, ya da 0.1 M fosfat buffer ile pH 7.2’ye ayarlanan %8.0 (w/v) sodyum klorit içeren ve Petri kutularında ya da mikroskop lamı üzerinde 2-3 mm kalınlıkta dökülen agar jeller kullanılarak kullanılabilir. Bir şablon ve kesici kullanarak 5mm çapında ve birbirinden 2-5 mm uzaklıkta agar üzerinde gözler açılır. Gözlerin dizilişinde her şüpheli serumun yanında ya bilinen pozitif serum ya da antijen yer almalıdır. Bunun sonucunda bilinen pozitif, süpheli serum ve nükleokapsit antijeni arasında süreklilik gösteren bir identite hattı (tanımlama hattı, ya da çizgisi) meydana gelir. Her ayıraçtan yaklaşık 50 µl her göze ilave edilmelidir.
Presipitin çizgileri yaklaşık 24-48 saat sonra gözlenebilir, ancak bunun görülmesi antikor ve antijenin yoğunluğuna bağlı olabilir. Bu çizgiler en iyi şekilde arkadan aydınlatılan karanlık zemin üzerinde gözlemlenebilir. Bilinen pozitif kontrol gözleri arasındaki presipitin çizgisi ile antijen ve test gözü arasındaki çizginin sürekli olması durumunda spesifik pozitif sonuç kaydedilmiş olur. Çapraz çizgiler pozitif kontrol serumunda bulunan antikorlarla aynı olmayan test serumundan dolayı meydana gelmiş kabul edilir.

EK 9

AI virüs antikorlarının tespitinde kullanılan serolojik testler:

Hangi Virüs H alt tipinin sorumlu olduğu bilinen eradikasyon programlarında ya da homolog virüsün antijen olarak kullanılması yolu ile, enfeksiyon delili için HI testleri kullanılarak serolojik izleme yapılabilir.

Eğer H alt tipi bilinmiyorsa influenza A tipi ile enfeksiyon delili için grup spesifik antijenlere yönelen antikorların tespitinden elde edilebilir.. Bu amaç için ya bir immünodoubledifüzyon testi ya da bir ELISA testi kullanılabilir (ELISA ile ilgili bir problem, konukçu immünglobulinlerinin tespit edilmesine dayalı olmasından dolayı testin konukçunun belirlenmesidir). Tip A influenza nükleoproteinine yönelik monoklonal antikorların kullanıldığı ve Tip A influenza virüsü nükleoproteinini gösteren duyarlı ve spesifik bir ELISA mevcuttur.
Su kuşları immünodoubledifüzyon testlerine nadiren pozitif reaksiyon verirler. Ve alt tip bilinmediği sürece bu tür kanatlılarda yalnızca H5 ve H7 alt tiplerin ile ilgili antikorların varlığının araştırılması uygun bir işlem olmaktadır.
Örnekler :
Sürü büyüklüğü 20’den daha az ise bütün kanatlılardan kan örnekleri alınır. Daha büyük sürülerden ise 20 kan örneği alınır (Böylece sürü büyüklüğüne bağlı olmaksızın sürünün %25 ya da daha fazlasının pozitif olması durumunda %99 olasılıkla en az bir pozitif serumun yakalanması mümkün olur). Kan pıhtılaşmaya bırakılmalı ve test için serumu alınmalıdır.
Antikorların aranması :

Bireysel serum örnekleri influenza virüsü HI testlerini inhibe etme yetenekleri yönünden test edilmelidir. Laboratuarlar arasında HA ve HI test prosedürleri arasında farklılıklar mevcuttur. Aşağıda tavsiye edilen örnekler, her iki test tipi için nihai hacmin 0.075 ml olduğu V-tabanlı mikrowell (mikro gözlü) plastik pleytlerin kullanımı için geçerlidir.

Hemaglütinasyon (HA) test Ayıraçları

1. 
   Fosfat tamponla pH 7.0-7.4 olan izotonik salin (PBS) (0.05M).
   
2. 
   En az üç spesifik patojenden ari tavuktan alınan (eğer bu yoksa düzenli olarak muayene edilen ve AI antikorlarından yoksun olduğu gösterilen kanatlılardan kan alınabilir)ve havuz oluşturulan kırmızı kan hücreleri (alyuvarlar) (RBC) eşit hacimde Alsever solusyonuna konur. Hücreler kullanımdan önce PBS’de üç kez yıkanırlar ve %1 süspansiyon şeklinde (paketlenmiş hücre v/v) kullanılırlar.
   
3. 
   Standart antijen olarak düşük virulensli H5 ve H7 virusları kullanılır.
   
4. 
   Pozitif ve negatif kontrol antiserumları.
   

Prosedür ;

1. 
   Plastik mikrotitre pleytinin (V tabanlı gözler kullanılmalıdır) her gözüne 0.025 ml PBS konur.
   
2. 
   İlk göze 0.025 ml virüs süspansiyonu konur (enfektif allantoik sıvı).
   
3. 
   Mikrotitrasyon sulandırıcısı kullanılarak pleyt boyunca virüsün iki katlı dilüsyonları oluşturulur (1:2 den 1:4.96’ya)
   
4. 
   Her göze ilave olarak 0.025 ml PBS konur.
   
5. 
   Her göze 0.025 ml, 1 % alyuvar konur.
   
6. 
   Hafifçe vurularak karıştırılır ve oda sıcaklığında 40 dakika bekletilerek alyuvarların çökmesi sağlanır (örneğin 20 ⁰C), ya da eğer ortam sıcaklığı çok yüksek ise 4 ⁰C’de 60 dakika bekletilir. Bu yolla zaman kontrollü alyuvarlar bariz bir düğme üzerine/halinde çökmelidir.
   
7. 
   Pleyt eğilerek alyuvarların gözyaşı şeklindeki akımının varlığı ya da yokluğu ile HA tespit edilir. HA bulunmayan gözlerin virüs içermeyen kontrol gözleriyle aynı oranda akım göstermesi beklenir.
   
8. 
   HA titresi alyuvarların aglütinasyonunu sağlayan en yüksek dilüsyondur. Bu dilüsyon 1 HA ünitesi olarak (HAÜ) kabul edilebilir. HA titresini daha doğru bir şekilde tayin etme metodu HA virüs testlerinin birbirine yakın başlangıç dilüsyonlarında yapılmasıdır örneğin 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 gibi. Bu uygulama HI testlerinde kullanılacak antijenin doğru şekilde hazırlanması için önerilmektedir.
   

Hemaglütinasyon İnhibisyon (HI) test Ayıraçları

1. 
   PBS
   
2. 
   Her 0.025 ml’de 4 veya 8 HAÜ içerecek şekilde PBS ile sulandırılmış virüs içeren allantoik sıvı.
   
3. 
   %1 tavuk alyuvarları
   
4. 
   Negatif ve Pozitif tavuk kontrol serumu.
   

Prosedür:

1. 
   Plastik V tabanlı mikrotitre pleytinin her gözüne 0.025 ml PBS konur.
   
2. 
   Pleytin ilk gözüne 0.025 ml serum serum konur.
   
3. 
   Serumun pleyt boyunca 0.025 ml hacminin iki katlı dilüsyonları yapılır..
   
4. 
   Her göze 0.025 ml içinde 4 HAÜ virüs / antijen konur ve en az 30 dakikla süre ile oda sıcaklığında bekletilir (örneğin 20 ⁰C) ya da 4 ⁰C’de 60 dakika bekletilir. .
   
5. 
   Her göze 0.025 ml, %1 (v/v) tavuk alyuvarları konur ve hafifçe karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında 40 dakika süresince alyuvarların çökmesi beklenir (örneğin 20 ⁰C) ya da eğer ortam sıcaklığı çok yüksek ise 4 ⁰C’de 60 dakika bekletilir. Zaman kontrollü alyuvarların bariz bir düğme üzerine/halinde çökmeleri beklenir.
   
6. 
   4 HAÜ antijenin tam olarak inhibisyonunu en yüksek serum dilüsyonu HI titresini verir. Aglütinasyonun tayini pleytlerin sallanması ile sağlanır. Yalnızca içinde kontrol gözleri ile aynı oranda akım gösteren alyuvar bulunan gözlerin inhibisyon gösterdikleri kabul edilmelidir (yalnızca 0.025 ml Alyuvar ve 0.05 ml PBS).
   
7. 
   Test sonuçlarının geçerliliği negatif kontrol serumuna ve pozitif kontrol serumuna kıyasla değerlendirilir. Negatif kontrol serumunda ¼’ten yukarı titre olmamalıdır (karşılıklı gösterildiğinde >2² ya da >log₂) pozitif kontrol serumunda ise titre bilinen titrenin dilüsyonunda olmalıdır.
   

4 HAÜ antijenine karşı 1/16 ya da daha yukarı serum dilüsyonunda (karşılıklı gösterildiğinde 2 ⁴ veya log₂ 4) eğer bir inhibisyon varsa HI titreleri pozitif olarak kabul edilebilir. Bazı laboratuarlar HI testlerinde 8 HAÜ kullanmayı tercih etmektedirler. Bu durum kabul edilebilir olmakla birlikte pozitif titrenin 1/8 (2³ veya log₂ 3) ve daha fazla olduğu sonuçların yorumlanmasını etkileyebilmektedir.

Bu testte tavuk serumları nadiren nonspesifik pozitif reaksiyonlar vermektedirler ve serumların herhangi bir ön işlemden geçirilmesine gerek yoktur. Tavuk dışındaki türlerin serumları bazan tavuk alyuvarlarını aglütine edebilmektedir, bu nedenle bu özellik önceden tespit edilerek serumun tavuk alyuvarları ile adsorbsiyonu yolu ile sorun giderilmelidir. Bu işlem için her bir 0.5 ml antiseruma 0.025 ml paketlenmiş tavuk alyuvarı eklenir, hafifçe sallanır ve ve en az 30 dakika bekletilir; daha sonra alyuvarlar 800 g’de 2-5 dakika santrifüj edilerek pelet haline getirilir adsorbe edilen serumlar boşaltılır. Buna alternatif olarak araştırılmakta olan kanatlı türlerinin alyuvarları kullanılabilir.
Agar Jel İmmünodifüzyon (AGID) Testi
İnfluenza A virüsünün varlığını göstermek için tercih edilen metot bütün influenza A vıruslarının ortak özelliği olan nükleokapsitlerinin veya matriks antijenlerinin gösterilmesidir. Bu özellik AGID testlerinde herhangi bir influenza A virüsüne karşı aranacak antikorların varlığının ya da yokluğunun tespitini mümkün kılmaktadır. AGID testlerinde bu işlem genellikle ya konsantre virüs preparatları kullanılarak ya da enfekte koriyoallantoik membranlardan elde edilen virüs ekstraktları kullanılarak gerçekleştirilir.
Bu iki antijenden her ikisi de immünodoubledifüzyon testlerinde %1 agaroz, ya da 0.1 M fosfat tampon ile pH 7.2’ye ayarlanan %8.0 (w/v) sodyum klorit içeren ve Petri kutularında ya da mikroskop lamı üzerinde 2-3 mm kalınlıkta dökülen agar jeller kullanılarak kullanılabilir. Bir şablon ve kesici kullanarak 5mm çapında ve birbirinden 2-5 mm uzaklıkta agar üzerinde gözler açılır. Gözlerin dizilişinde her şüpheli serumun yanında ya bilinen pozitif serum ya da antijen yer almalıdır. Bunun sonucunda bilinen pozitif, süpheli serum ve nükleokapsit antijeni arasında süreklilik gösteren bir identite hattı (tanımlama hattı, ya da çizgisi) meydana gelir. Her ayıraçtan yaklaşık 50 µl her göze ilave edilmelidir.
Presipitin çizgileri yaklaşık 24-48 saat sonra saptanabilir, ancak bu, antikor ve antijenin yoğunluğuna bağlı olabilir. Bu çizgiler en iyi şekilde arkadan aydınlatılan karanlık zemin üzerinde gözlemlenebilir. Bilinen pozitif kontrol gözleri arasındaki presipitin çizgisi ile antijen ve test gözü arasındaki çizginin sürekli olması durumunda spesifik pozitif sonuç kaydedilmiş olur. Çapraz çizgiler pozitif kontrol gözünde bulunan antikorlarla aynı olmayan test serumundan dolayı meydana gelmiş kabul edilir.


EK 10

Patojenite tayini

YPAI teriminin anlamı virüsün virulent bir suşunun varlığına işaret eder. Bu terim göz yaşı akıntısı, solunum güçlüğü, sinüzitis, baş ve yüzde ödem, deride tüysüz bölgelerin siyanotik görünümü ve ishal gibi klinik belirtileri taşıyan tavuklara ait bir hastalığı tarif etmek için kullanılmaktadır. Tek belirti ani ölüm de olabilir. Bu işaretler konukçu ile ilgili kanatlının yaşı, diğer organizmaların varlığı ve çevre şartları gibi şartlara bağlı olarak çok büyük farklılıklar gösterebilmektedir. Ayrıca ortam şartlarının kötü olması durumunda, yalnızca hafif klinik belirti oluşturan ya da hiç belirti oluşturmayan virüsler da yüksek patojenik AI’yi taklit edebilir.

Bir AI virüsünün yüksek patojenik olarak sınıflandırılmasında esas alınan kriterler:

Virulens tayin metodu olarak intravenöz patojenite indeks (IVPI) testi kullanılmıştır. Hastalığı teyit etmek ve koruyucu önlemler alınmasını sağlamak amacı ile aşağıdaki tanımlar geçerlidir:

"6 haftalık tavuklarda IVPI’nin >1.2 olduğu bir influenza A virüsünün neden olduğu bir kanatlı enfeksiyonu veya hemaglütinin parçalanma bölgesinde nükleotit sekansında multiple temel amino asitlerin varlığının gösterildiği influenza A virusları H5 veya H7 alt tipleri ile enfeksiyon ".
Intravenöz Patojenite Endeks (IVPI) Testi

1. 
   Mevcut En düşük geçiş düzeyinden enfektif allantoik sıvı tercihen herhangi bir seçimin yapılmadığı başlangıç izolasyonunda izotonik salin içinde 1/10 oranında sulandırılır.
   
2. 
   0.1 ml miktarında sulahdırılmış virüs 1o adet 6 haftalık tavukların her birine intravenöz yolla enkekte edilir (SPF kanatlılar kullanılmalıdır).
   

3. 
   Kanatlılar 10 gün boyunca 24 saat aralıklarla muayene edilir.
   

4. 
   Her bir gözlemde her bir kanatlı için normal (0), hasta (1), şiddetli hasta (2) ya da ölü (3) şeklinde derecelendirme yapılır (hasta ve şiddetli hasta kanatlılar subjektif klinik değerlendirme olup normalde "hasta" kanatlılar aşağıda sayılan klinik belirtilerden birini "şiddetli hasta" kanatlılar ise birden fazlasını sergileyen kanatlılar olarak sınıflandırılmalıdır: Solunum bozukluğu, depresyon, ishal, açıkta kalan deri kısımlarının ya da gerdanın siyanozisi, yüz ve/veya başta ödem, sinirsel belirtiler. Ölüm sonrası kalan her günlük gözlemde ölü bireyler üçerli sayılmalıdır).
   

5. 
   IVPI, 10 günlük süre içinde her kanatlı için gözlem başına sayı (skor) ortalamasıdır. Endeksin 3.00 olmasının anlamı 24 saat içinde bütün tavukların öldüğünü, endeksin 0.00 olmasının anlamı ise 10 günlük gözlem süresi içinde hiçbir tavuğun klinik belirti göstermediğini belirtmesidir.
   

Plak oluşturma yeteneğinin tayini:

1. 
   Pleyt üzerinde optimum sayıda plak varlığını sağlayacak virüs dilüsyon oranı kullanmak genellikle en iyi yoldur. PBS içinde 10^-6’ya kadar 10-kat dilüsyonlar yeterlidir.
   
2. 
   5 cm çapında Petri kaplarında civciv embryo hücrelerinden ya da uygun bir hücre hattından (örneğin Madin-Darby sığır böbreği) konfluent monolayerler hazırlanır.
   
3. 
   Her bir petri kabına her virüs dilüsyonundan 0.2 ml eklenir ve 30 dakika süre ile virüsün absorbsiyonu (emilmesi) sağlanır.
   
4. 
   PBS ile üç kez yıkama sonrası enfekte hücreler %1 mg/ml tripsin içeren ya da hiç tripsin içermeyen %1 w/v agar içeren ilgili vasat ile kaplanır. Kaplama vasatına serum ilave edilmemesine dikkat etmelidir.
   
5. 
   37 ⁰C’de 72 saat inkübasyondan sonra plakların yeterli büyüklüğe erişmesi beklenir. Bunlar en iyi agarın üst katmanının (kaplamasının) kaldırılması ve hücre monolayerin 25 v/v etanolde kristal mor (%0.5 v/v ) ile boyanması ile görülürler.
   
6. 
   Kaplama içinde tripsinin varlığında inkübe edildiklerinde bütün virüsler belirgin plaklar oluştururlar. Kaplama içinde tripsin bulunmaması durumunda yalnızca tavuklar için patojen olan virüsler plak oluştururlar.
   

1. 
   Ön ayrım
   

Virüsün yayılmasını sınırlamaya yönelik kontrol tedbirlerinin en kısa zamanda alınmasının öneminden dolayı her bölgesel laboratuarın izole edilen hemaglütinasyon oluşturan bütün virusları Newcastle virüsüne ek olarak influenza virusları H5 ya da H7 alt tipi olarak tanımlayabilecek konumda olması gerekmektedir. HI testinde kullanılacak hemaglütinasyon sıvıları şu tarife uygun olarak kullanılmalıdır.

2⁴ (1:16) , ya da influenza A H5 veya H7 alt tipleri için spesifik poliklonal antiserum ile daha yüksek ve en az 2⁹’luk bir titr olarak pozitif inhibisyon ara kontrol tedbirlerinin yürürlüğe konması için ön tanımlama olarak hizmet edebilir...
2- Doğrulayıcı tanımlama:
İnfluenza vıruslarının 15 hemaglütinin alt tipi ve 9 nöraminidaz alt tipinin bulunmasından ve bunların her biri arasında da varyasyonların olabilmesinde dolayı her bölge laboratuarında influenza izolatlarının tam antijenik karakterizasyonunu sağlayacak antiserumların bulundurulması hem kullanışlı değildir hem de ekonomik değildir, bununla birlikte her bölge laboratuarı şu işlemleri yapabilmelidir:

1. 
   Tarif edildiği şekilde grup antijenlerinin arandığı immünodoubledifüzyon testi kullanarak bir izolatın influenza A virüsü olduğunu teyit edebilmelidir (bölge laboratuarları eğer tercih ederlerse grup antijenlerinin aranmasına yönelik immünofloresan ya da ELISA tekniklerini kullanabilirler);
   
2. 
   İzolatın H5 ya da H7 alt tipi olup olmadığını tayin edebilmelidir;
   
3. 
   Tarif edildiği şekilde altı haftalık tavuklarda intravenöz patojenite endeks testi uygulayabilir. 1.2’den daha yüksek intravenöz patojenite endeksi virüsün varlığına işaret eder ve kontrol tedbirlerinin eksiksiz olarak uygulanmasını gerektirir (ulusal laboratuarlarda, tarif edildiği gibi ayrıca, bir izolatın kültürlerde plak oluşturma kapasitesini tayin eden testlerin yapılması yararlı bir uygulama olabilir).
   

Bölgesel laboratuarlar bütün AI ve H5 ve H7 izolatların özelliklerinin tam tespiti için en kısa zamanda URL’ye göndermelidirler.
3- İzolatların tip ve özellikleriyle ilgili daha ileri tespit
URL, bölgesel laboratuarlardan aldığı bütün hemaglütinasyon özellikli virusları daha ileri antijenik ve genetik çalışmalara tabi tutar, ve hastalığın ya da hastalıkların epizootiyolojisinin daha ayrıntılı olarak anlaşabilmesi için çalışır ve bunları işlev ve görevleri itibarı ile referans olan Avrupa Birliğinin Uluslararası Referans Laboratuarına gönderir.
Bu çalışmalara ek olatrak URL kendisine gelen tüm influenza vıruslarının tam antijenik tip çalışmasını yapacaktır. URL ayrıca 1.2’den daha yüksek intravenöz patojenite endeksine sahip olmayan H5 ve H7 virusları için, hemaglütinin proteini için parçalanma bölgesinde multiple temel amino asitlerin bulunup bulunmadığının ortaya konması için hemaglütinin geninin nükleotit sekansının çıkarılmasını da yapmalıdır.

Nonpatojenik virüslerle enfeksiyon

• 
  Enfekte kanatlılarda klinik belirtiler görülmemekle birlikte bunlar serolojik değişim gösterebilirler.. Bu virüslerden bazılarının genom mutasyonu yolu ile virulent hale gelme potansiyelleri bulunmaktadır.
  

Düşük ya da orta derecede patojenik virüslerle enfeksiyon

• 
  Tavuk ya da hindilerde klinik belirtiler tespit edilemeyenden orta ya da şiddetli dereceye ve şiddetli solunum hastalığına kadar değişen özellikte olabilir ve enfeksiyöz laringotrakeitis ve diğer solunum yolu enfeksiyonları ile karıştırılabilir.
  
• 
  Mortalite oranları kafes yumurtacılarında %3’ten et tavuklarında %15’e kadar değişebilir.
  
• 
  Yumurtacılarda yumurta verimi %45 azalabilir ve normal düzeye 2 - 4 haftada dönülebilir.
  
• 
  Salgınlarda mutasyon yoluyla virülens gösterilmiştir.
  

Yüksek patojenik virüslerle enfeksiyon

• 
  Tavuk ve hindilerdeki belirtiler şiddetli solunum belirtileri, aşırı sulu gözler, sinüzitis, ibik, gerdan ve bacakların siyanozisi başta ödem, tüylerin kabarması, ishal ve sinirsel belirtiler.
  

• 
  Hastalığın başlamasından sonraki son yumurtalar genellikle kabuksuzdur.
  

• 
  Ani ölümlerin (perakut) meydana geldiği akut olaylarda klinik belirtiler dikkati çekmeyebilir ve ölümler hastalığın ilk belirtilerinden 24 saat sonra görülmeye başlar, genellikle de 48 saaat içinde ölümler görülür. Diğer olaylarda daha değişken belirtiler görülür ve ölümler bir hafta kadar gecikebilir. Perakut ve akut olaylarda mortalite oranlarının hemen hemen %100’e ulaştığı bildirilmiştir.
  

• 
  Şiddetli derecede etkilenmiş bazı tavuklar iyileşebilir, fakat çok seyrek olarak tekrar yumurtlayabilirler..
  

Hindilerde hastalık tavuklardakine benzer. Ancak genellikle tavuk kolerası, hindi korizası ve kolibasillozis gibi ikincil enfeksiyonlarla komplike olur.

EK 11

Kit No 1 ( RV için ekipman listesi)

1) Kağıt ve kalemler

2) Epidemiyolojik soru formları

3) Klinik ziyaret ve örnekleme işlemleri için gerekli ekipman:

a. 2 adet atılabilir elbise

b. 5 çift atılabilir ayakkabı koruyucu

c. 2 çift lastik eldiven ve 5 çift lateks eldiven

d. Atılabilir şapkalar ve yüz maskeleri

e. Atılabilir tulum

f. Koruyucu gözlükler (gözlüklerin her iki tarafı da kapalı olmalıdır)

g. Dirençli ve geçirgen olmayan tıbbi atık çantaları

h. Kağıt peçete ve havlular

ı. 5 adet sızdırmaz kap

j. 5 adet sızdırmaz ve suya dayanıklı plastik çanta

k. Elektrikli meşale

l. Aktif dezenfektan solüsyon

m. 2 adet kalem ve not defteri

14. 
    100 adet 2.5 ml. lik enjektör ve iğneleri
    
15. 
    Kan tüpleri ve tüp taşıyıcılar
    
16. 
    Nebuliser (püskürtücü)
    

r. 100 adet ince küçük plastik çanta, (poşet)

s. 2 adet cerrahi makas

t. 2 çift forseps

u. Bant

v. 2 adet keçe uçlu kalem

y. 1 termik kap

z. 5 dondurulmuş buz paketi
Bu kitlerden en az iki takım RV’in iş merkezinde her zaman hazır olarak bulundurulmalıdır.

EK 12

Kit No 2 (LV için gerekli ekipman listesi)

a. 1 termik kap

b. 4 çift forseps

c. 2 adet cerrahi makas

d. 1 bıçak

e. Bant

f. Etiketler ve kalemler

g. 100 adet 2.5 ml’lik enjektörler ve iğneleri

h. Steril svablar

i. Virüs taşıma vasatı içeren 50 adet test tüpü

j. 10 sızdırmaz konteynır

k. 2 adet atılabilir elbise

l. 5 çift atılabilir ayakkabı koruyucu

m. 5 çift lateks eldiven

n. Atılabilir şapkalar ve yüz maskeleri

o. 10 adet siyah çöp poşeti

p. 50 kauçuk bant

q. Püskürtücü içinde dezenfektan solüsyon

r. Mukavva kutu

14. 
    Dezenfektan, alkol, sabun, kağıt peçete-havlu
    
15. 
    Cam kaplarda %10 nötral formalin, 500ml, (patolojik incelemeler için)
    
16. 
    Cam kaplarda gliserinli %50 serum fizyolojik, 250ml, (bakteriyolojik incelemeler için)
    
17. 
    Etiket
    
18. 
    Lam – lamel kutuları
    
19. 
    Cam kalemi
    
20. 
    Hayvan ve yemden alınan örneklerin konduğu 10 poşet
    

EK 13

HASTALIK ŞÜPHESİ OLAN BİR HASTALIK MERKEZİNDE

EL KOYMA TUTANAĞI ÖRNEĞİ

 .............................. tarihinde .................. .................... ................... ................... ................... ..... ................. ............... ................. .................... ....................... .................. .................... adresinde oturan Bay/Bayan ................. .......... ........... ................. ..................... tarafından ileri sürülmüş olan .............. ................... .................. ...................... ............ kuşkusu durumunun mevcut olduğu ................... ..................... ................. ................. ............... ..................... ............... ........... .............. .......... adresinde kurulu kümeste var olan kanatlıların sahibi/sorumlusu ................. doğumlu bay/bayan .............. ............. .......... ’a Veteriner Hekim ................. ................. tarafından 3285 Sayılı Hayvan Sağlığı ve Zabıtası Kanunu’nun Ceza Hükümlerinden 47. Maddesinin hükümleri bildirilmiş ve yerel sağlık makamlarının ilgili önlemlerini bekleyerek aşağıdaki talimatları verilmiştir:

 1) İşletmede mevcut kanatlıların kayıt edilmesi ve epidemiyolojik araştırmada görevli veteriner hekimlere yardımcı olunması;

2) İşletmede mevcut kanatlılara ve diğer hayvan türlerine el konulması;

3) Şüphe altındaki kanatlıların, sağlıklı olanlardan ayrılarak ayrı ayrı muhafaza altına alınması;

4) Diğer önlemleri beklerken, ölü kanatlıların saklanması;

5) Köpeklerin, kedilerin ve avlu hayvanlarının sınırlanması;

6) İşletme dışına gübre çıkartılmasının yasaklanması:

7) Kanatlıların ve diğer hayvan türlerinin işletmeye girişinin yasaklanması;

8) Kanatlıların veya diğer hayvan türlerinin etlerinin veya karkaslarının ve ayrıca yemlerin, aletlerin, nesnelerin ve herhangi diğer malzemenin çıkışının önlenmesi;

9) İşletmede mevcut olan et ve karkasların korunması yükümlülüğü;

10) Kümesten kümese olmak üzere kişilerin, malzemelerin ve taşıtların hareketini durdurmak;

11) Koruma personelinin kümesteki hayvanlarla her türlü şekilde temas etmesini önlemek;

12) Kanatlıların bulundukları yerlerin ve bunların yakınında bulunan alanların titiz şekilde dezenfekte edilmesi.

 Bay/Bayan ............... ............... .............. ................ şüphe duyulan kanatlıların koruyucusu olarak tayin edilmiştir ve yukarıdaki hususların icra edilmesinden ve iş bu tutanağın kabulünden sorumludur.

 Mal sahibi/İşletme Sorumlusu Muhtar veya BelediyeBaşkanı

 

Hükümet

Veteriner Hekimi
 

NOTLAR:

Tutanak hastalıktan şüphe duyulan işletme içinde var olan hayvanların sahibine veya herhangi bir şekilde buradan sorumlu olan kişiye tebliğ edilmelidir.

EK-14

 

TAAHHÜT BEYANI ÖRNEĞİ

 

Bay/Bayan ............ ............. ............ .........’ye ait işletmede tavuk vebası kuşkusu bulunduğundan ........ ........ .......  doğumlu .............. ............. ............. ............... .............. ............... ............... .......... ............. ........... .......... .......... ........... ........... ............ ................ ............... ......... ....... ........ adresinde ikamet eden Bay/Bayan ........... ............... ............. işine istinaden bugün tarihi itibariyle 3 gün boyunca kanatlı türlere ait olan diğer hayvanlar ile temas kurmayacağını, aynı zamanda muhtemel hastalık taşıyıcısı olan giymiş olduğu giysileri uygun araçlar ile yıkayacağını ve dezenfekte edeceğini taahhüt eder.  ..../..../........

 

 

İmza

EK 7.5

EK 15

MARAZİ MADDE GÖNDERME PROTOKOLÜ

KURUM ADI : ..../.../200...

A-GÖNDERENİN :

Adı-Soyadı :..............................................................................................................

Adresi :..............................................................................................................

Tel-Fax :..............................................................................................................

e-mail :..............................................................................................................
B-HAYVAN SAHİBİNİN :

Adı-Soyadı :...............................................................................................................

Adresi :...............................................................................................................

Tel. No :...............................................................................................................

C-HAYVANA AİT BİLGİLER :

1- Kulak No :...............................................................................................

2- Türü :...............................................................................................

3- Irkı-Cinsiyeti :...............................................................................................

4- Yaşı :...............................................................................................

5- Verilen Besin Maddeleri : Slaj(............),Konsantre Yem(.........),Kaba Yem(............)

6- Bakım ve Beslenme : Ahırda (............), Merada (...........)
D-NUMUNEYE AİT BİLGİLER :

1- Gönderilen Numunenin Türü :................................................................................

2- Numune Adedi :................................................................................

3- Numunenin Alındığı Tarih :................................................................................

4- Atık ise kaç günlük olduğu :................................................................................

4- Uygulanan Aşılar :................................................................................

5- Uygulanan Aşı Seri No’ları :................................................................................

6- Aşı Uygulama Tarihleri :................................................................................

7 - Numunenin gönderilme şekli : Formolde ( ), Dondurulmuş ( ),Soğuk şartlarda ( )

Taşıyıcı besiyeri içinde ( ), Normal şartlarda ( ), Diğer ( )
E-HASTALIK DURUMU :

1- Sürüdeki hayvan sayısı (..........), hastalanan (.........), ölen (......), iyileşen (......), sirayete maruz (........)

2- Hayvanın daha önce geçirdiği hastalık veya hastalıklar :.........................................................................

.....................................................................................................................................................................................

3- Daha önce yapılan tedavi ve tarihi :...............................................................................................

.....................................................................................................................................................................................

4- HASTALIK HAKKINDA BİLGİ :

( Klinik Belirtiler, lezyonlar, süresi, etkilenen hayvan sayısı ve otopsi bulguları )

...............................................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

...........................................................................................................................................................................................

4- ŞÜPHE EDİLEN HASTALIK : (..........................................................)

F- İSTENİLEN LABORATUVAR MUAYENELERİ:

1- Bakteriyolojik ( ), 2- Serolojik ( ), 3- Parazitolojik ( ), 4- Toksikolojik ( )

5- Patolojik ( ), 6- Virolojik ( )

İMZA

EK 16
AVIAN INFLUENZA

EPİDEMIYOLOJİK ARAŞTIRMA FORMU

Tarih ...../...../.....

Dr. ........................................................................... Telefon no .................….......….......
Şüphe N. .......……......….…
Teyit N. ...........………..…..
Kuruluş ismi ………………………………….............….........................................................
Adres…………………………….............……........……………………………................…..
Belediye .....................….............…......... İl…………...................... Telefon .....…....…..........
i

lçe/bölge/mahalle ……………………………………….

Çiftlik kodu ya da kimlik numarası
Sahibi

.......................................................................................................................................................

Şirket ……....................................................................................................................................
Şirket sahibinin adresi ...............................................................Telefon ..………….............…..
Bilgileri veren kişi...........................................................................………...…........…..............
.......................................................................................................................................................

Çiftlik Veteriner hekimi Dr. ................................................... Var HAYIR EVET

ÇİFTLİKLE İLGİLİ BİLGİLER

TESİSİN TİPİ :

Endüstriyel Kırsal Bayi Parekendeci

KATEGORİ/ÜRETİM HATTI:

Sofralık yumurta  Et kanatlıları 

Tip :

Büyük ebeveyn

E

beveyn

Piliçler

E

t-tipi (broyler)

Yumurtacı