Azərbaycan miLLİ elmlər akademiyasi
Stabil DNT-nin ayrılması
Yüklə 65,28 Kb. Pdf görüntüsü
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- 4.1.2. Stabil DNT-nin ayrılması
- 4.2. Quraqlıq stresinin iki cərgəli və çox cərgəli arpa genomunda əmələ gətirdiyi dəyişikliklər və onlara fitohormonların təsiri
- Cədvəl 4.1
180 4.1.2. Stabil DNT-nin ayrılması Labil DNT-ni ayırdıqdan sonra çöküntü yenidən həvəngə keçirilir, 6 həcm bufer məhlulu ilə soyuq kamerada 15 dəqiqə müddətində əzilir. Bufer: 0.6M NaCl-0.001M EDTA-0.05M tris-HCl pH 8.0-0.5% DDS (dodetilsulfat natri). Çöküntü əzilərək qarışdırdıqdan sonra sentrafuqada 2500g 15 dəq. Fır- ladılır. Çöküntünün üzərinə yenidən 6 həcm bufer məhlulu əlavə edilərək, təkrar soyuq şəraitdə əzilərək qarışdırılır, sen- trafuqada təkrar fırladılır, üst hisssəsi süzülür. I və II eks- traklar birləşdirilir, 2 həcm 96%-li spirtlə çökdürülür. 4.1.3. Qalıq DNT-nin ayrılması Stabil DNT ayırıldıqdan sonra çöküntünün üzərinə 6 həcm fosfat buferi əlavə etməklə otaq temperaturunda yaxşıca əzilərək qarışdırılır. Bufer: 0.18M NaCl-0.001M EDTA-0.02M fosfat buferi pH-8.0-5%-PASK-1% DDS. Bufer qarışığı ilə çöküntü su hamamında 60 0 temperaturda 5 dəq. müddətində saxlanılır. So- yuduqdan sonra 2500g dövrə ilə sentrafuqada 15 dəq. fırladılır, süzülür, 2 həcm 96%-li spirtlə çökdürülür. Spirtlə çökdürülmüş labil, stabil, qalıq DNT-lər 2 dəfə sentrafuqada fırladılır. DNT fraksiyalarını (labil, stabil, qalıq) digər qarışıqlardan tam təmiz- ləmək məqsədilə aşağıdakı ardıcıllıqla yuyulma aparılır. Hər yuyulma sentrafuqada 5 dəqiqə fırladılaraq başa çatdırılır. 1. 96% - li spirtlə - 1 dəfə (otaq temperaturunda) 2. 80% - li spirtlə - 3 dəfə su hamamında 80 0 temperaturda saxladıqdan sonra soyuq şəraitdə 3. 5%-li ÜXS (üçxlorsirkə turşusu)-da 2 dəfə soyuq şəraitdə 4. 80% - li spirtlə - 1 dəfə otaq temperaturunda 5. 96% - li spirtlə - 1 dəfə otaq temperaturunda 181 6. 3:1 spirt efir qarışığında çöküntülər qarışdırılaraq 2 dəfə su hamamında 65-70 dərəcə temperaturda saxlanılır və sentrafuqada həmin dövrədə fırladılaraq üst hissəyə atılır. 7. Çöküntülər təmiz efirlə qarışdırılır, sentrafuqada fırladılır üst hissəsi süzülərək təmiz DNT əldə edilir. Alınmış ağ toz şəklində DNT üzərinə 0.5n NaOH məhlulu əlavə edilərək, 18 saat müddətində 37 0 C temperaturda termostata hidroliz olunmağa qoyulur. Vaxt başa çatdıqdan sonra hidrolizat sentrafuqada 12000g dövrə 10 dəq. fırladılır, süzülür, çöküntü atılır. Çöküntünün üst hissəsi 0.5n NaON-la 10 ml-ə çatdırılır və 57%-li HClO 4 -la pH=1 olana qədər neytrallaşdırılır. DNT-ni RNT-dən ayırmaq üçün süzüntü (formalaşma getsin deyə) 40 dəq. müddətində soyuducuda saxlanılır. Sonra sentrafuqada fırladılır, sentrafuqat RNT olub, çökün- tü DNT-dən ayrılır. Çöküntü 2 dəfə 0.5n HClO 4 -la yuyulur, sentrafuqada fırladılır, ümumi həcm 40 ml-ə çatdırılır. RNT su hamamında 30 dəq. 80 0 C temperaturda hidrolizə qoyulur. Hid- roliz prosesindən sonra RNT 200 dəfə durulaşdırılır, miqdarı spektrofotometrdə 270 və 290 nm dalğa uzunluğunda ölçülür. Çöküntünün (DNT-nin) üzərinə 10 ml 0.5n HClO 4 tökülür, 60 0 C temperaturda 20 dəqiqə müddətində hidrolizə qoyulur, soyu- dulur, müvafiq durulaşma aparılır, miqdarına spektrofotometrdə 270 və 290 nm dalğa uzunluğunda baxılır. RNT və DNT-nin miqdarı aşağıdakı düsturlarla hesablanır: RNT (mq/100qr)=Fərq x 55.2 x durulaşma x 100 yaş yarpaq (qr) DNT (mq/100qr)=Fərq x 53.5 x durulaşma x 100 yaş yarpaq (qr) 182 4.2. Quraqlıq stresinin iki cərgəli və çox cərgəli arpa genomunda əmələ gətirdiyi dəyişikliklər və onlara fitohormonların təsiri Quraqlığa davamlı, iki cərgəli Hüseyn 1 arpa sortunun yar- paqlarında quraqlıq stresi və fitohormonların təsirindən DNT frak- siyaları və RNT miqdarında baş verən dəyişmələri göstərən nə- ticələr cədvəl 4.1 və şəkil 4.1-də verilmişdir. Cədvəl və şəkildən göründüyü kimi quraqlıq stresi zamanı, davamlı arpa sortunda DNT fraksiyalarının, xüsusilə də labil xromatin DNT-sinin miq- darı artır və buna müvafiq təsirindən labil DNT-nin miqdarı 21,9%, RNT-nin miqdarı isə 16,5% çoxalmışdır. Bu fakt, yəni da- vamlı bitki genotiplərində euxromatin DNT-sinin artması, genetik sistemin fizioloji labilliyinin yüksəlməsini, başqa sözlə xromosom aparatının fəallaşmasını göstərir. Stresdən 48 saat sonra Hib+Kin fitohormon kompleksinin təsiri nəticəsində RNT-nin miqdarı 30,1% labil DNT-nin miqdarı 38,5% artmış, DNT-nin digər fraksiyalarında da müvafiq artım müşahidə edilmişdir. Bu rəqəmlər, fitohormon kompleksinin ge- nomun aktivliyinin yüksəltdiyini, onun quruluş və funksiyasında pozitiv dəyişmələrə səbəb olduğunu göstərir. Cədvəl 4.1 Hüseyn 1 arpa sortunda quraqlıq stresi və Hib + Kin hormon kompleksinin təsirindən RNT miqdarı və DNT fraksiyalarında baş verən dəyişmələr (100q yaş çəkidə mq-la) Təcrübə variantı RNT DNT fraksiyaları Ümumi DNT Labil Stabil Qalıq Stresdən 24 saat sonra Kontrol 22,26±0,22 5,97±0,18 3,98±0,03 0,31±0,01 10,26 PEQ 26,35±0,47 7,28±0,12 4,53±0,10 0,40±0,02 12,21 Yüklə 65,28 Kb. Dostları ilə paylaş:
|