Bakterie mléčného kvašení (bmk) jsou heterogenní skupinou mikroorganismů, které mohou fermentovat různé živiny za vzniku mléčné kyseliny

5diskuze

V současné době se pro rychlou identifikaci mikroorganismů stále ve větší míře využívají molekulárně biologické postupy, zejména polymerázová řetězová reakce. Reálné vzorky a hrubé lyzáty buněk však často obsahují inhibitory PCR, které jsou příčinou falešně negativních výsledků nebo snižují citlivost PCR. Nejvíce používanou metodou izolace DNA je fenolová extrakce. Uvedený postup je však pracný a zdlouhavý. Proto jsou hledány alternativní metody izolace bakteriální DNA. K izolaci DNA z buněk bakterií mléčného kvašení se osvědčila metoda využívající nespecifické adsorpce DNA na magnetické nosiče v prostředí vysoké koncentrace PEG 6000 a chloridu sodného (Rittich a kol. 2006). Tento postup izolace DNA byl zvolen i pro tuto diplomovou práci.

1. Kultivace a mikroskopie buněk

Jednotlivé kmeny Lactobacillus paracasei, narostlé na MRS agaru, byly naočkovány do tekutého MRS média. Po 24hodinové kultivaci, kdy byl získán dostatečný nárůst buněk, byly tyto kultury přeočkovány do nového MRS média

a současně rozočkovány na MRS agar. Na MRS agaru byly po 24hodinové kultivaci pozorovány velké mléčně zbarvené kolonie a buňky narostlé v tekutém MRS médiu byly použity pro přípravu hrubých lyzátů.

Z každého bakteriálního kmene byly zhotoveny fixované preparáty, obarveny podle Grama a mikroskopicky pozorovány. Morfologie buněk odpovídala popisu

a charakteristikám laktobacilů uvedeným v literatuře (Stiles a Holzapfel 1997) –
tzn. grampozitivní, štíhlé tyčky tvořící řetízky rozmanité délky.

2. Izolace DNA metodou fenolové extrakce

Metodou fenolové extrakce byla izolována DNA z hrubých lyzátů buněk testovaných kmenů Lactobacillus paracasei. Pro zjištění koncentrace a čistoty této DNA byla spektrofotometricky změřená absorbance v rozmezí vlnových délek 220–320 nm. Koncentrace DNA z jednotlivých kmenů se pohybovala v rozmezí 72 až 93 ng/l, což bylo dostačující pro její detekci na 0,8% agarózovém gelu. Čistota DNA byla zjišťována z poměrů absorbancí A_260nm/A_280nm a pohybovala se v rozmezí 2,04 – 2,13, což svědčilo

o částečné přítomnosti RNA ve vzorcích. Nicméně takto izolovaná DNA byla amplifikovatelná (Sambrook a Russel 2001).

Chromozomální DNA byla relativně intaktní. Pro stanovení citlivosti PCR byla DNA ředěná na 10 ng/l až 100 fg/l a amplifikována pomocí PCR s rodově specifickými primery LbLMA1-rev a R16-1 (Dubernet a kol. 2002). Výsledné produkty o délce 250 bp byly detekovány na 1,5% agarózovém gelu, všechny s pozitivním výsledkem, tj. až do koncentrace 100 fg/ml. Tím byla prokázána dostatečná citlivost PCR.

3. Izolace DNA z hrubých lyzátů buněk Lactobacillus paracasei s využitím magnetických nosičů pokrytých COOH skupinami v prostředí 2,5 M NaCl
   a 8 % PEG

V práci byla ověřena hypotéza, zda adsorpce genomové DNA z hrubých lyzátů buněk v prostředí poly(ethylen glykolu) 6000 a chloridu sodného na magnetické nosiče umožní eliminovat vliv těchto inhibitorů PCR a zda pořadí smíchání jednotlivých komponent při přípravě separační směsi ovlivňuje množství izolované DNA.

V devadesátých letech 20. století byly poprvé využity magnetické nosiče funkcionalizované karboxylovými skupinami pro izolaci PCR produktů (Rittich a kol. 2006, Křížová a kol. 2005). V této práci byly použity magnetické nosiče Fkol77ox.
a P(HEMA-co-GMA) pro izolaci vysokomolekulární genomové DNA. Tyto částice
se liší pouze velikostí a pravděpodobně i v množství karboxylových skupin na svém povrchu, což koreluje s množstvím eluované DNA.

Předpokládá se, že mechanismus adsorpce DNA na povrch magnetických nosičů je založen nejprve na precipitaci DNA v prostředí PEG 6000 (vzrůstající koncentrace PEG 6000 vede k redukci vodní aktivity a helikální struktura B-DNA je pak změněna

na A-DNA) a poté na interakci dusíkatých bazí DNA s karboxylovými skupinami přítomnými na povrchu nosičů prostřednictvím vodíkových můstků. Přítomnost chloridu sodného tuto interakci jen zvyšuje. Nicméně celý tento mechanismu adsorpce DNA
na povrch magnetických částic je poněkud komplikovaný, jelikož DNA přítomná v roztoku neinteraguje pouze s funkčním skupinami na nosičích (Rittich a kol. 2006).

V dřívějších pracích (Křížová a kol. 2005) byly testovány různé koncentrace PEG 6000 a chloridu sodného na maximální adsorpci DNA na tyto nosiče. Bylo zjištěno, že nejúčinnější adsorpce DNA byla dosažena při koncentraci PEG 6000  5% a NaCl  1 M (Rittich a kol. 2006). Proto byly v této práci použity koncentrace 8% PEG 6000 a 2,5 M NaCl.

Při přípravě separační směsi pro magnetickou separaci chromozomální DNA byly jednotlivé komponenty smíchávány v různých pořadích (dle kapitoly 3.5.7.2). Během inkubace této směsi se část genomové DNA z hrubých lyzátů buněk všech tří kmenů Lactobacillus paracasei adsorbovala jak na Fkol77ox. tak na P(HEMA-co-GMA) nosiče. Jako pozitivní kontrola uvolnění DNA z buněk byl testován supernatant, tj. směs po navázání DNA na magnetické nosiče. DNA navázaná na magnetický nosič byla následně promyta a eluována z nosičů do TE pufru. Pomocí spektrofotometrického stanovení koncentrace DNA bylo potvrzeno, že nejúčinnější adsorpce DNA
na magnetické nosiče bylo docíleno smícháním jednotlivých komponent použitých
při přípravě separační směsi v pořadí 1-2-4-3-5, tzn. H₂O–NaCl–magnetické nosiče–PEG 6000–hrubý lyzát. Takto izolovanou DNA bylo možno jako jedinou bezprostředně detekovat na 0,8% gelu. Druhá nejvyšší koncentrace izolované DNA byla v případě, že do separační směsi byly přidávány komponenty v pořadí 1-2-4-5-3, nicméně tuto DNA již nebylo možné na 0,8 % gelu detekovat. Při smíchání komponent v pořadí 1-2-3-4-5
a 1-2-3-5-4 byly u izolované DNA zjištěny nejnižší koncentrace.

DNA izolovaná z hrubých lyzátů buněk pomocí magnetických nosičů stále odpovídala kvalitě vhodné pro PCR, neboť byla amplifikovatelná ve všech případech. Nejintenzivnější PCR produkty byly detekovány v eluátech, co obsahovaly nejvíce DNA, tj. v případě, kdy komponenty separační směsi byly míchání v pořadí 1-2-4-3-5.

4. Selektivní separace biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů s navázaným streptavidinem

V případě použití magnetických nosičů PGMA-NH₂-STV, které byly při přípravě separační směsi ředěny 1, 2, 4 PBS pufrem (1 koncentrovaným), nedošlo k úbytku nepřečištěných PCR produktů ze separační směsi (tzn. navázání PCR produktů

na magnetické nosiče) a zároveň se nepotvrdila eluce PCR produktů z těchto magnetických nosičů. Tato separace byla opakovaně testována a vždycky se stejným výsledkem. Tato skutečnost mohla být způsobena stérickou nedostupností funkčních skupin pro navázání bakteriální DNA. Proto v dalších experimentech byly použity komerčně dostupné částice.

Navázání PCR produktů na komerční magnetické nosiče pokryté streptavidinem bylo potvrzeno úbytkem PCR produktů ze separační směsi. Dále se prokázalo, že biotin-streptavidin interakce může být disociována v přítomnosti PCR vody při teplotě 70 °C (Holmberg a kol. 2005). Množství biotinylovaných amplikonů eluovaných

z magnetických nosičů bylo detekováno agarózovou gelovou elektroforézou.
Je nutné podotknout, že detekce slabého nebo žádného biotinylovaného PCR produktu po magnetické separaci na agarózovém gelu mohla být zapříčiněna nadbytkem biotinylovaného primeru v PCR reakční směsi. Biotinylované primery, které během syntézy DNA v průběhu PCR nebyly využity, se snadněji vážou na streptavidin než biotinylované PCR produkty [návod přiložený u komerčních magnetických nosičů s navázaným streptavidinem: Products for Biotechnology With Magnetic Porous Glass (MPG^)]. Proto bylo nezbytné biotinylované PCR produkty přečistit.

Biotinylované PCR produkty přečištěné metodou reverzní imobilizaci DNA

na pevnou fázi a pomocí fenolové extrakce nebyly v dostatečné koncentraci
pro následnou magnetickou separaci. Proto byly produkty přečišťovány pomocí PCR purifikačního kitu QIAquick. Kvalita přečištěných biotinylovaných PCR produktů byla ověřena pomocí agarózové gelové elektroforézy a ukázalo se, že tyto produkty jsou v dostatečné koncentraci pro následnou magnetickou separaci.

V případě použití magnetických nosičů PGMA-NH₂-STV opět nedošlo k úbytku biotinylovaných PCR produktů (přečištěných) ze separační směsi a zároveň

se nepotvrdila eluce těchto amplikonů z magnetických částic. Tato separace byla opakovaně testována a vždycky se stejným výsledkem, který potvrzuje výše uvedený závěr o možné stérické nedostupnosti navázaných ligandů.

Naopak navázání PCR produktů na komerční magnetické nosiče pokryté streptavidinem bylo potvrzeno úbytkem amplikonů ze separační směsi a zároveň jejich elucí z těchto magnetických částic do PCR vody, což bylo detekováno agarózovou gelovou elektroforézou.

6závěr

DNA izolovaná z buněk sbírkových kmenů druhu Lactobacillus paracasei metodou fenolové extrakce byla relativně intaktní, jejím zředěním na 10ng/ml

až 100 fg/ml a následnou rodově specifickou PCR byla stanovena citlivost PCR. Výsledné produkty byly detekovány pomocí agarózové gelové elektroforézy, všechny
s pozitivním výsledkem.

Dále byla DNA izolována z hrubých lyzátů buněk pomocí magnetických nosičů

s navázanými COOH skupinami v prostředí 2,5 M NaCl a 8% PEG 6000. Byl prokázán vliv pořadí smíchávání jednotlivých komponent při přípravě separační směsi na množství izolované DNA. Tato izolovaná DNA byla amplifikovatelná ve všech případech.

Navázání PCR produktů na komerčně dostupné magnetické nosiče pokryté streptavidinem bylo potvrzeno úbytkem těchto amplikonů v separační směsi. Dále bylo prokázáno, že biotin-streptavidin interakce může být disociována v přítomnosti PCR vody při teplotě 70 °C. Navázání PCR produktů na magnetické nosiče PGMA-NH₂-STV nebylo potvrzeno.

7seznam literatury

Bernardeau M., Gueguen M.  Vernoux J. P. (2006): Beneficial lactobacilli in food and feed: long-term use, biodiversity and proposals for specific and realistic safety assessments. FEMS Microbiology Reviews 30: 487–513.

Boyle R. J., Robins-Browne R. M., Tang M. L. K (2006): Probiotic use in clinical practice: what are the risks? American Journal of Clinical Nutrition 83: 1256–64.
Caplice E., Fitzgerald G. F. (1999): Food fermentations: role of microorganisms in food production and preservation. International Journal of Food Microbiology 50: 131–149.
Claesson M., van Sinderen D.  O`Toole P. W. (2007): The genus Lactobacillus –
a genomic basis for understanding its diversity. FEMS Microbiology Letters 269: 22–28.
Coeuret V., Dubernet S., Bernardeau M., Gueguen M., Vernoux J. P. (2003): Isolation, characterisation and identification of lactobacilli focusing mainly on cheeses and other dairy products. Lait 83: 269–306.
Coeuret V., Gueguen M., Vernoux J. P. (2004): Numbers and strains of lactobacilli
in some probiotic products. International Journal of Food Microbiology 97: 147–156.
Collado M. C., Hernández M. (2007): Identification and differentiation of Lactobacillus, Streptococcus and Bifidobacterium species in fermented milk products with bifidobacteria. Microbiological Research 162: 86–92.
D`Aimmo M. R., Modesto M., Biavati B. (2007): Antibiotic resistance of lactic acid bacteria and Bifidobacterium spp. isolated from dairy and pharmaceutical products. International Journal of Food Microbiology 115: 35–42.
Dubernet S., Desmasures N., Guéguen M. (2002): A PCR-based method for identification of lactobacilli at the genus level. FEMS Microbiology Letters 214: 271– 275.

Furet J. P., Quénée P., Tailliez P. (2004): Molecular quantification of lactic acid bacteria in fermented milk products using real-time quantitative PCR. International Journal

of Food Microbiology 97: 197–207.
Hartemink R., Rombouts F. M. (1999): Comparison of media for the detection
of bifidobacteria, lactobacilli and total anaerobes from faecal samples. Journal
of Microbiological Methods 36: 181–192.
Hennequin C., Kauffmann-Lacroix C., Jobert A., Viard J. P., Ricour C., Jacquemin J. L., Berche P. (2000): Possible role of catheters in Saccharomyces boulardii fungemia. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases 19: 16–20.
Holmberg A., Blomstergren A., Nord O., Lukacs M., Lundeberg J., Uhlén M. (2005): The biotin-streptavidin interaction can be reversibly broken using water at elevated temperatures. Electrophoresis 26, 501–510.
Holzapfel W. H., Haberer P., Geisen R. Björkroth J., Schillinger U. (2001): Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition. American Journal of Clinical Nutrition 73: 365S–73S.
Horák D., Rittich B., Španová A. (2007): Carboxyl-functionalized magnetic microparticle carrier for isolation and identification of DNA in dairy products. Journal
of Magnetism and Magnetic Materials 311: 249–254
Isolauri E., Sütas Y., Kankaanpää P., Arvilommi H., Salminen S. (2001): Probiotics: effects on immunity. American Journal of Clinical Nutrition 73: 444S–50S.
Jandová B., Kotoučková L. (1996): Praktikum z mikrobiologie. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, Brno, 69 s.
Klaenhammer, T. R., Barrangou, R., Buck B. L, Azcarate-Peril, M. A., Altermann E. (2005): Genomic features of lactic acid bacteria effecting bioprocessing and health. FEMS Microbiology Reviews 29, 393–409.
Klaenhammer, T. R., Kullen M. J. (1999): Selection and design of probiotics. International Journal of Food Microbiology 50: 45–57.
Klein G., Pack A., Bonaparte C., Reuter G. (1998): Taxonomy and physiology
of probiotic lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology 41: 103–125.
Křížová J., Španová A., Rittich B., Horák D. (2005): Magnetic hydrophilic methacrylate-based polymer microspheres for genomic DNA isolation. Journal of Chromatography A, 1064: 247–253.
Lacroix J. M., Jarvi K., Batra S. D. Heritz D. M., Mittelman M. W. (1996): PCR-based technique for the detection of bacteria in semen and urine. Journal of Microbiological Methods 26: 61–71.
Leuschner R. G. K., Bew J., Coeuret V., Vernoux J. P., Gueguen M. (2003):
A collaborative study of a method for the enumeration of probiotic lactobacilli in animal feed. Food Microbiology 20: 57–66.
McCartey A. L. (2006): Enumeration and identification of mixed probiotic and lactic acid bacteria starter cultures. Probiotic dairy products: 98–119.
Moreira J. L. S., Mota R. M., Horta M. F., Teixeira S. M. R., Neumann E., Nicoli J. R., Nunes Á. C. (2005): Identification to the species level of Lactobacillus isolated
in probiotic prospecting studies of human, animal or food origin by 16S-23S rRNA restriction profiling. BMC Microbiology 5: 15.
Prodělalová J., Rittich B., Španová A., Petrová K., Beneš M. J. (2004): Isolation
of genomic DNA using magnetic cobalt ferrite and silica particles. Journal
of Chromatography A, 1056: 43–48.
Reuter G., Klein G., Goldberg M. (2002): Identification of probiotic cultures in food samples. Food Research International 35: 117–124.
Rittich B., Španová A., Horák D., Beneš M. J., Klesnilová L., Petrová K., Rybnikář A. (2006): Isolation of microbial DNA by newly designed magnetic particles. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces 52: 143–148.
Rosypal S. (2006): Úvod do molekulární biologie, díl první, Brno.
Saarela M., Mogensen G., Fondén R., Mättö J., Mattila-Sandholm T. (2000): Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. Journal of Biotechnology 84: 197–215.
Sambrook J., Russel D. W. (2001): Molecular cloning: A laboratory manual (II), 3^rd ed. Cold Spring Laboratory Harbor Press, New York.
Salminen S., von Wright A., Morelli L., Marteau P., Brassart D., de Vos W. M., Fondén R., Saxelin M., Collins K., Mogensen G., Birkeland S. E., Mattila-Sandholm T. (1998): Demonstration of safety of probiotics – a review. International Journal of Food Microbiology 44: 93–106.
Salminen S. J., Gueimonde M., Isolauri E. (2005): Probiotics that modify disease risk. Journal of Nutrition 135: 1294–1298.
Sedláček I. (2007): Taxonomie prokaryot. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, Brno.
Stiles M. E., Holzapfel W. H. (1997): Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. International Journal of Food Microbiology 36: 1–29.
Šafařík I., Šafaříková M. (1999): Use of magnetic techniques for the isolation of cells. Journal of Chromatography B, 722: 33–53.
Španová A., Horák D., Soudková E., Rittich B. (2004): Magnetic hydrophilic methacrylate-based polymer microspheres designed for polymerase chain reactions applications. Journal of Chromatography B, 800: 27–32.
Španová A., Rittich B., Beneš M. J., Horák D. (2005): Ferrite supports for isolation
of DNA from complex samples and polymerase chain reaction amplification. Journal
of Chromatography A, 1080: 93–98.
Temmerman R., Scheirlinck I., Huys G., Swings J. (2003a): Culture-independent analysis of probiotic products by denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology 69: 220–226.
Temmerman R., Pot B., Huys G., Swings J. (2003b): Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products. International Journal of Food Microbiology 81: 1–10.
Tilsala-Timisjärvi A., Alatossava T. (1997): Development of oligonucleotide primers from the 16S-23S rRNA intergenic sequences for identifying different dairy and probiotic lactic acid bacteria by PCR. International Journal of Food Microbiology 35:
49–56.
Vaughan E. E., Heilig H., Ben-Amor K., de Vos W. M. (2005): Diversity, vitality and activities of intestinal lactic acid bacteria and bifidobacteria assessed by molecular approaches. FEMS Microbiology Reviews 29: 477–490.
Vaughan E. E., Mollet B., de Vos W. M. (1999): Functionality of probiotics and intestinal lactobacilli: light in the intestinal tract tunnel. Current Opinion
in Biotechnology 10: 505–510.
Vojtíšková M. (2007): Speciální metody analýzy mikroorganismů – přednášky.
Zhong W., Millsap K., Bialkowska-Hobrzanska H., Reid G. (1998): Differentiation of Lactobacillus species by molecular typing. Applied and Environmental Microbiology 64: 2418–2423.

8publikace výsledků

Výsledky prezentované v této diplomové práci byly publikovány ve formě abstraktu a posteru na vědecké konferenci:

XII. Pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů, 6.–7. 2. 2008 v Brně

Separace amplikonů specifických pro rod Lactobacillus
s využitím magnetického nosiče

Dagmar Janoszowská¹, Alena Španová¹, Bohuslav Rittich¹, Daniel Horák^2
1Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Ústav experimentální biologie

Tvrdého 14, 602 00 Brno

²Ústav makromolekulární chemie AV ČR, Heyrovského nám. 2, 100 00 Praha
Disperzní kopolymerací 2-hydroxyethyl methakrylátu (HEMA) a glycidyl methakrylátu (GMA) v přítomnosti koloidního železa byly připraveny různé magnetické mikročástice P(HEMA-co-GMA) (1:1). Nosiče byly funkcionalizovány COOH skupinami pro izolaci celkové DNA a streptavidinem pro selektivní separaci biotinylované DNA. Pro testování nosičů byl zvolen postup s využitím 3 kmenů baktérií mléčného kvašení druhu Lactobacillus paracasei s potenciálními probiotickými účinky. Buňky byly kultivovány v MRS médiu/37 °C/přes noc, z buněk byly připraveny hrubé lyzáty a z nich byla izolována DNA pomocí magnetických nosičů – P(HEMA-co-GMA)-COOH a Fkol77-COOH – v prostředí 2,5 M NaCl a 8% polyethylenglykolu (PEG) 6000. Při přípravě separační směsi byly smíchávány komponenty v různých pořadích a testován vliv na množství izolované DNA. Intaktnost DNA byla ověřena pomocí agarózové gelové elektroforézy a spektrofotometricky stanovena koncentrace a čistota DNA. S takto vyizolovanou DNA byla provedena PCR s rodově specifickými primery LbLMA1-rev
a R16-1 (Dubernet a kol. 2002). PCR produkty délky 250 bp byly detekovány pomocí agarózové gelové elektroforézy.

V další části práce byla provedena PCR s biotinylovaným primerem (biotin přisyntetizován na 5´konci rodově specifického primeru R16-1). Pro amplifikaci byly použity stejné podmínky jako u nebiotinylovaného primeru. Biotinylované PCR produkty byly separovány pomocí magnetického nosiče s imobilizovaným streptavidinem. Nejprve byla testována vazba biotinylovaných PCR produktů na nosič, poté uvolnění PCR produktů z nosiče dle Holmberga a spol. 2005. Jako kontrola byly použity komerčně dostupné nosiče pokryté streptavidinem.

Dubernet S., Desmasures N., Guéguen M. (2002): A PCR-based method for identification of lactobacilli
at the genus level. FEMS Microbiology letters 214, 271–275.
Holmberg A., Blomstergren A., Nord O., Lukacs M., Lundeberg J., Uhlen M. (2005): The biotin-streptavidin interaction can be reversibly broken using water at elevated temperatures. Electrophoresis 26, 501 –510.

 

Práce byla podpořena projektem 2B06053 a Výzkumným záměrem MSM0021622415 Ministerstva školství České republiky.