Bakterie mléčného kvašení (bmk) jsou heterogenní skupinou mikroorganismů, které mohou fermentovat různé živiny za vzniku mléčné kyseliny

Identifikace bakterií rodu Lactobacillus

Jak bylo popsáno výše, tradiční klasifikace BMK včetně laktobacilů je založena

na fenotypových charakteristikách (zejména biochemických a fyziologických) (viz. 1.2.2). Ačkoli použití fenotypových testů může být pro identifikaci určitých BMK výhodné, je nutné si uvědomit, že shodný fenotyp kmenů nemusí znamenat stejný nebo blízce příbuzný genotyp. Z tohoto důvodu je výzkum soustředěn na aplikaci molekulárně biologických technik, které zvyšují účinnost identifikace (Dubernet a kol. 2002, Collado
a Hernández 2007). V Tabulce 4 jsou srovnány základní metody nejčastěji používané pro identifikaci BMK, včetně laktobacilů.
Tabulka 4: Metody používané pro identifikaci bakterií mléčného kvašení (upraveno dle Prodělalová 2004, Reuter a kol. 2002).




Metoda Nároky Rozlišovací schopnost Reproduko-

na práci vatelnost




Fenotypové metody

Morfologická analýza nízké nejvýše rod střední

Fyziologická analýza střední nejvýše rod nízká

Biochemická charakterizace nízké rod nebo druh střední

Proteinový profil (SDS-PAGE) vysoké druh vysoká
Genotypové metody

PCR metody

PCR se specifickými primery nízké v závislosti na použitém primeru vysoká

RFLP střední druh až kmen vysoká

AFLP vysoké druh až kmen vysoká

RAPD nízké druh až kmen nízká

Rep-PCR nízké druh až kmen vysoká

PFGE vysoké kmen vysoká

Ribotypizace vysoké druh až kmen vysoká

Hybridizace se sondami vysoké rod až druh vysoká

Sekvencování vysoké rod až druh vysoká

Analýza plazmidové DNA nízké kmen neuvedena

1. Fenotypové metody

Klasické fenotypové metody se používají pro identifikaci druhu, biotypu

a dokonce určitých kmenů v rámci druhu (Reuter a kol. 2002).

Častým krokem při určování neznámého izolátu ze stolice, příp. mléčného výrobku je kultivace. Pro detekci laktobacilů existuje několik typů kultivačních médii, např. neselektivní MRS médium (de Man, Rogosa a Sharp), kultivační půda Rogosa nebo selektivní půda LAMVAB (Hartemink a Rombouts 1999). V praxi je stále nejpoužívanější MRS médium, doporučené ke kultivaci laktobacilů směrnicemi ISO (Leuschner a kol. 2003).

Na kultivaci navazují metody popisující morfologii buněk, fyziologické vlastnosti (respiratorní typ, růstová teplota, růst v přítomnosti NaCl) a biochemické charakteristiky (způsob fermentace sacharidů, produkce izomerů kyseliny mléčné, koagulace mléka, přítomnost určitých enzymů) (Coeuret a kol. 2003). Tyto výsledky mohou být podpořeny profilem celobuněčných rozpustných proteinů (SDS-PAGE).

Fenotypová charakterizace je problematická při identifikaci blízce příbuzných druhů jako jsou například zástupci skupiny Lactobacillus acidophilus (Klaenhammer

a kol. 1999). V takových případech je nezbytná aplikace genotypových metod.

2. Genotypové metody

V současné době se pro studium bakterií mléčného kvašení používají tyto metody:

PCR a metody založené na PCR. K dispozici jsou jak primery rodově specifické pro rod Lactobacillus (Dubernet a kol. 2002), tak primery druhově specifické (Tilsala-Timisjärvi a Alatossava 1997). Primery rodově specifické (stejně tak i druhově specifické) byly navrženy na základě rozdílů v nukleotidové sekvenci mezerníkové oblasti mezi geny kódujícími 16S a 23S-rRNA (Coeuret a kol. 2003) a v sekvenci genu pro 16S rRNA (Tilsala-Timisjärvi a Alatossava 1997, Lacroix a kol. 1996). Častou metodou pro identifikaci bakterií z reálných vzorků je druhově-specifická PCR, případně PCR v kombinaci s denaturačně gradientovou elektroforézou (PCR-DGGE) (Temmerman a kol. 2003a, Coeuret a kol. 2003, Vaughan a kol. 2005).

Rychlou metodou umožňující identifikaci bakterií na úrovní kmene je náhodná polymerázová řetězová reakce (RAPD), někdy také nazývaná AP-PCR (arbitrary primed PCR). Vzhledem k náhodnému charakteru oligonukleotidových sekvencí používaných

v RAPD, nevyžaduje metoda předchozí znalost sekvence studovaného genomu (Prodělalová 2004, Coeuret a kol. 2003)

Dalšími technikami, které jsou založené na PCR, jsou např. PCR v reálném čase (real-time PCR), multiplexová PCR nebo amplifikace repetitivních bakteriálních DNA sekvencí (Rep-PCR) (Furet a kol. 2004, McCartney 2006).

Sekvencování je stanovení primární sekvence nukleotidů v molekule genomové DNA. Jedná se o jedno z nejlepších a nejprůkaznějších stanovení, ale v současnosti je ještě příliš drahé a složité pro praktickou aplikaci u bakteriálních izolátů v běžných laboratořích (Sedláček 2007).

Pulzní gelová elektroforéza (PFGE) je jednou z nejpoužívanějších metod
pro diferenciaci bakterií na úrovni kmene (Coeuret a kol. 2004, Coeuret a kol. 2003). Její nevýhodou je časová náročnost (4–5 dní) (Klein a kol. 1998).

Ribotypizace je citlivou a rychlou metodou pro diferenciaci druhů rodu Lactobacillus. Ribotypizace zahrnuje přípravu restrikčních fragmentů genomové DNA, které obsahují celé nebo část genů kódujících 16S a 23S rRNA, a jejich rozdělení pomocí agarózové gelové elektroforézy. Tyto fragmenty jsou následně přeneseny na nylonovou membránu (Southern blotting) a následně hybridizovány s oligonukleotidovými sondami odvozenými z rDNA (Zhong a kol. 1998, McCartney 2006, Coeuret a kol. 2003). Ribotypizace má dvě hlavní výhody: a) geny pro rRNA jsou vysoce konzervativní, proto jedna sonda může být použita pro subtypizaci řady druhů, b) většina baktérií obsahuje větší počet ribozomálních operonů, proto je možné získat dobře odlišitelné DNA fragmenty dovolující interdruhové a intradruhové rozlišení (Vojtíšková 2007).

DNA-DNA hybridizace. Důležitým krokem pro hybridizaci je příprava DNA sondy, což jsou krátké jednořetězcové fragmenty (20–30 bp) DNA, radioaktivně nebo neradioaktivně značené. Tyto sondy se komplementárně vážou na cílovou sekvenci, kterou lze následně podle značky snadno identifikovat. Této schopnosti je využíváno
k vyhledávání a charakterizaci specifických nukleotidových sekvencí v genomových knihovnách, v cytologických preparátech, při mapování genomů aj. (Coeuret a kol. 2003).
K rychlé identifikaci a kvantifikaci různých druhů bakterií mléčného kvašení
z komplexních mikrobiálních ekosystémů bez jejich předcházející izolace slouží genotypové metody (Furet a kol. 2004). Většina z nich je založena na analýze 16S a 23S rRNA, neboť geny kódující tuto nukleovou kyselinu jsou jednak vysoce konzervativní
a jednak obsahují vysoce variabilní části, což je využíváno v určování fylogenetických vztahů mezi bakteriemi (Vaughan a kol. 2005, Vaughan a kol. 1999).

1. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

PCR je jednoduchá, rychlá a flexibilní metoda, která umožňuje amplifikovat

in vitro specifický úsek DNA. Metoda byla poprvé popsána na počátku 70. let. V uvedené době však byla obtížně proveditelná a proto se nepoužívala. Počátkem 80. let byla znovu objevena a uvedena do praxe biochemikem americké společnosti Cetus Corporation Kary Mullisem a jeho spolupracovníky (Sambrook a Russell 2001).

Pro identifikaci mikroorganismů se PCR běžně používá ve dvou základních podobách. První způsob vychází ze znalosti sekvence DNA studovaného organismu, který se může vyskytovat i ve velmi malém množství a/nebo ve směsné kultuře. Druhý způsob provedení PCR striktně vyžaduje použití čisté kultury studovaného mikroorganismu. Není však nutná předchozí znalost sekvence studované DNA (Sambrook a Russell 2001).

Podstatou PCR je syntéza určitého jednoho či více úseků DNA. Po hybridizaci krátkých oligonukleotidů (tzv. primerů) ke komplementárním úsekům na DNA řetězci dojde za katalytického působení DNA-dependentní-DNA polymerázy k syntéze nového řetězce nukleové kyseliny (Sambrook a Russell 2001, Rosypal 2006).

Reakce probíhá v opakovaných reakčních cyklech, kdy každý z cyklů se skládá

ze tří kroků, které jsou charakterizovány různou délkou času a odlišnými požadavky
na teplotu:

1. 
   Denaturace dvouřetězcové DNA – teplota denaturace DNA je určena obsahem guaninu a cytosinu (G+C). Optimální denaturační teplota je 94–95 °C. Pro amplifikaci templátové DNA o obsahu G+C 55 mol % a méně je doporučována doba denaturace
   45–60 s. V prvním cyklu PCR bývá doba denaturace prodloužena až na 5 minut, aby
   se zvýšila pravděpodobnost, že dojde k úplnému oddělení řetězců dlouhé molekuly DNA (Sambrook a Russell 2001, Carrino a Lee 1995).
   
2. 
   Hybridizace primerů k jednotlivým řetězcům DNA templátu (tzv. annealing). Určení teploty hybridizace je klíčovým krokem. Příliš vysoká teplota brání napojení primerů k cílové sekvenci na DNA, nízká teplota hybridizace vede ke snížení specificity reakce a k amplifikaci nežádoucích fragmentů DNA. Hybridizace obvykle probíhá
   při teplotě o 3–5 °C nižší než je teplota, při níž dochází k denaturaci DNA. I když
   pro výpočet této teploty existuje celá řada postupů, je třeba teplotu hybridizace primerů experimentálně optimalizovat.
   
3. 
   Syntéza nového řetězce DNA probíhá při teplotě optimální pro katalytické působení DNA polymerázy, která se v případě Taq polymerázy pohybuje mezi
   72–78 °C. Trvání kroku je dáno rychlostí syntézy, pro fragmenty dlouhé 1 kbp je udávaná 1 minuta. Často je doba syntézy v posledním kroku reakce prodlužována až trojnásobně, aby byla zaručeno dosyntetizování všech amplikonů (Sambrook a Russell 2001).
   

Ukončením třetího kroku je dokončen první cyklus reakce a amplikony se stávají substráty druhého cyklu. V prvních cyklech PCR dochází k syntéze komplementárního DNA řetězce od místa navázání primerů. V dalším cyklu vznikají první molekuly, jejichž délka je shodná s délkou úseku vymezeného sekvencemi komplementárními k primerům. Od třetího cyklu se tento fragment amplifikuje geometrickou řadou, zatímco množství delších amplifikačních produktů roste lineárně.

Cykly se opakují, přičemž jejich počet závisí na počátečním množství molekul templátové DNA a na účinnosti hybridizace a syntézy komplementárního DNA řetězce. Vycházíme-li z jedné molekuly templátu a 32 cyklů, můžeme teoreticky, při 100% účinnosti reakce ve všech cyklech, získat 1,07  10⁹ kopií DNA (Sambrook a Russell 2001).

3.