Bakterie mléčného kvašení (bmk) jsou heterogenní skupinou mikroorganismů, které mohou fermentovat různé živiny za vzniku mléčné kyseliny

Magnetické nosiče a možnosti jejich využití k izolaci DNA pro PCR diagnostiku

Polymerázová řetězová reakce je rychlá a přesná metoda pro identifikaci mikroorganismů. Nicméně při běžné identifikaci mikroorganismů z reálných vzorků

se může vyskytnout problém ve formě falešně negativních výsledků, které mohou být zapříčiněné extracelulárními a intracelulárními inhibitory PCR. Z tohoto důvodu byla pozornost soustředěna na rozvoj rychlých a robustních metod pro izolaci a purifikaci DNA z komplexních vzorků (Rittich a kol. 2006, Španová a kol. 2004, Křížová a kol. 2005, Prodělalová a kol. 2004).

Klasický postup izolace genomové DNA zahrnuje fenol/chloroformovou extrakci a DNA precipitaci ethanolem. Nicméně tato metoda, vyžadující aplikaci toxických komponent (fenol, chloroform), je poměrně složitá a časově náročná. Proto byly vyvinuty alternativní metody izolace DNA, využívající například reverzní imobilizaci DNA

na pevnou fázi (solid-phase reversible immobilization of genomic DNA, SPRI). Mezi pevné fáze, na které se adsorbuje DNA, patří mimo jiné methakrylátové magnetické nosiče (Rittich a kol. 2006, Španová a kol. 2005, Křížová a kol. 2005, Prodělalová a kol. 2004). Výhodami metody izolace DNA pomocí magnetických nosičů jsou snadnější
a rychlejší separace DNA (a to ve vysoké kvalitě) přímo z hrubého lyzátu komplexních vzorků (např. buněk mléčných výrobků či lyofilizátů), vyloučení práce s toxickými organickými rozpouštědly, možnost automatizace a miniaturizace procesu (Šafařík a kol. 1999, Rittich a kol. 2006).

1. Charakteristika nosičů s magnetickými vlastnostmi

Magnetické částice vykazují magnetické vlastnosti jen v přítomnosti vnějšího magnetického pole. Nevykazují však reziduální magnetismus, a pokud nejsou v bezprostřední blízkosti magnetického pole, vytváří homogenní suspenzi (jsou tzv. paramagnetické).

Pro separaci celkové DNA se osvědčily hydrofilní neporézní nosiče o průměru asi
1 m (Obrázek 3). Tyto nosiče mají na svém povrchu karboxylové skupiny (výsledek oxidace hydroxylových skupin), pomocí nichž reverzibilně adsorbují DNA. Reverzibilní navázání DNA na tyto nosiče probíhá v přítomnosti poly(ethylen glykolu) 6000
a chloridu sodného (Horák a kol. 2006, Šafařík a kol. 1999).
Obrázek 3: Elektronová mikroskopie magnetických nosičů P(HEMA-co-GMA) (upraveno dle Španová a kol. 2004).

Pro selektivní separaci DNA bylo možné využit nosiče funkcionalizované streptavidinem s navázanou biotinylovanou sondou. Systém streptavidin-biotin je považován za nejsilnější nekovalentní biologicky známou interakci, jejíž disociační konstanta K_d je 4 ´ 10^-14 M. Vazba se tvoří velmi rychle a stabilně v širokém rozmezí pH a teploty. Streptavidin je protein izolovaný z aktinobakterie Streptomyces avidinii, zatímco biotin je vitamín ze skupiny B přítomný ve všech buňkách (Holmberg a kol. 2005).

2CÍL PRÁCE

Cílem diplomové práce byla:

• 
  Izolace DNA ze 3 kmenů bakterií rodu Lactobacillus pomocí fenolové extrakce, DNA amplifikovat pomocí PCR s rodově specifickými primery a stanovit citlivost PCR.
  

• 
  Izolace DNA z hrubých lyzátů buněk bakterií rodu Lactobacillus s využitím magnetických částic s navázanými COOH skupinami a otestování vlivu změny pořadí smíchávání jednotlivých komponent při přípravě separační směsi na množství izolované DNA.
  

• 
  Separace biotinylovaných PCR produktů specifických pro rod Lactobacillus
  s využitím magnetických nosičů s navázaným streptavidinem. K tomu použít jak nově syntetizované nosiče, tak komerčně dostupné nosiče.
  

3MATERIÁL A METODY

1. Použité mikroorganismy

V experimentech byly použity tyto bakteriální kmeny, které byly získány z České sbírky mlékařských mikroorganismů Laktoflóra (CCDM, Tábor, ČR):

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei CCDM 211/06

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei CCDM 212/06

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei CCDM 213/06

2. Chemikálie

Chemikálie pro přípravu médií a roztoků:

• 
  Agar (Pliva-Lachema, Brno, ČR)
  
• 
  Agaróza pro elektroforézu DNA (Serva, Heidelberg, SRN)
  
• 
  Bromfenolová modř (Sigma, St. Louis, USA)
  
• 
  Destilovaná voda
  
• 
  Dodecylsulfát sodný (SDS) (Lachema, Brno, ČR)
  
• 
  Ethanol (Lachema, Brno, ČR)
  
• 
  Ethidiumbromid (5 mg/ml) (Sigma, St. Louis, USA)
  
• 
  Ethylendiaminotetraoctová kyselina (EDTA) (Serva, Heidelberg, SRN)
  
• 
  Fenol (Lachema, Brno, ČR)
  
• 
  Ficoll 400 (Pharmacia, Uppsala, Švédsko)
  
• 
  Fuchsin bazický (Lachema, Brno, ČR)
  
• 
  Chlorid sodný (Lachema, Brno, ČR)
  
• 
  Chloroform (Lachema, Brno, ČR)
  
• 
  Izoamylalkohol (Pliva-Lachema, Brno, ČR)
  
• 
  Jodid draselný (Lachema, Brno, ČR)
  
• 
  Krystalová violeť (Lachema, Brno, ČR)
  
• 
  Kyselina boritá (Lachema, Brno, ČR)
  
• 
  MRS agar (Oxoid, Londýn, Velká Británie)
  
• 
  MRS Broth (Oxoid, Londýn, Velká Británie)
  
• 
  Lysozym (Reanal, Budapešť, Maďarsko)
  
• 
  Octan sodný (Lachema, Brno, ČR)
  
• 
  Polyethylenglykol (PEG) 6000 (Lachema, Brno, ČR)
  
• 
  Proteináza K (Sigma, St. Louis, USA)
  
• 
  RNáza A (Reanal, Budapešť, Maďarsko)
  
• 
  Tris-hydroxymethyl-aminomethan (Tris-base) (Amresco, Solon, USA)
  
• 
  Tween 20
  

Dále byly použity běžně dostupné chemikálie v kvalitě p.a.
Komponenty pro PCR:

• 
  Oligonukleotidové primery (Oligo-Biotech, Hradec Králové, ČR): LbLMA1-rev, R16-1, R16-1 s přisyntetizovaným biotinem na 5´ konci (bio-R16-1)
  

• 
  DNA standard 100 bp žebříček (Malamité, Moravské Prusy, ČR)
  
• 
  dNTP směs (10 mM) (Top-Bio, Praha, ČR)
  
• 
  Reakční pufr kompletní pro Taq DNA polymerázu 1.1 (10 koncentrovaný) (Top-Bio, Praha, ČR)
  
• 
  Taq DNA polymeráza 1.1 (1U/l) (Top-Bio, Praha, ČR)
  
• 
  Voda pro injekce ČSL 4 (Biotika, Slovenská L’upča, SR) – dále označována jako PCR voda
  

Magnetické nosiče:

• 
  Magnetické sklo – 5 μm; CPG, N.Y., USA
  
• 
  Magnetické mikročástice poly(2-hydroxyethyl methakrylát-co-glycidyl methakrylát) P(HEMA-co­-GMA) I - (1/1hm) s karboxylovými skupinami – velikost 2,2 m; 0,764 mmol -COOH/g. Šarže I. Částice byly připraveny na Makromolekulárním ústavu Akademie věd ČR v Praze (Ing. Daniel Horák, CSc.). V této práci označovány jako Fkol77ox. částice.
  
• 
  P(HEMA-co-GMA) II - (1/1hm) s karboxylovými skupinami – velikost 1,8 m. Šarže II. Částice byly připraveny na Makromolekulárním ústavu Akademie věd ČR v Praze
  (Ing. Daniel Horák, CSc.). V této práci označovány jako P(HEMA-co-GMA) částice.
  

• 
  PGMA-NH₂-STV – magnetické částice pokryté streptavidinem; 1,34 ng streptavidinu/g; koncentrace zásobního roztoku neuvedena. Částice byly připraveny na Makromolekulárním ústavu Akademie věd ČR v Praze (Ing. Daniel Horák, CSc.).
  
• 
  MPG^ Streptavidin (Middlesex, New Jersey) – magnetické částice pokryté streptavidinem; koncentrace zásobního roztoku 10 mg/ml