Bakterie mléčného kvašení (bmk) jsou heterogenní skupinou mikroorganismů, které mohou fermentovat různé živiny za vzniku mléčné kyseliny

Izolace DNA z hrubých lyzátů buněk Lactobacillus paracasei s využitím magnetických nosičů pokrytých COOH skupinami v prostředí 2,5 M NaCl
a 8% PEG

Bakteriální DNA byla izolována dle postupu uvedeného v kapitole 3.5.7. Byl testován vliv změny pořadí smíchávání jednotlivých komponent při přípravě separační směsi na množství izolované DNA.

1. Izolace DNA pomocí magnetických nosičů s různým pořadím přidávání komponent do separační směsi

Na agarózový gel byl nanesen jak supernatant obsahující hrubý lyzát buněk po odseparování části DNA magnetickými nosiči, tak DNA eluovaná z magnetických nosičů do TE pufru. Výsledky agarózové gelové elektroforézy jsou uvedeny na Obrázku 7 až 10.

Obrázek 7 – DNA, jenž byla separována způsobem, kdy do separační směsi byly přidávány komponenty v pořadí 1-2-3-4-5

Obrázek 8 – DNA, jenž byla separována způsobem, kdy do separační směsi byly přidávány komponenty v pořadí 1-2-4-3-5

Obrázek 9 – DNA, jenž byla separována způsobem, kdy do separační směsi byly přidávány komponenty v pořadí 1-2-4-5-3

Obrázek 10 – DNA, jenž byla separována způsobem, kdy do separační směsi byly přidávány komponenty v pořadí 1-2-3-5-4

Obrázek 7. Agarózová gelová elektroforéza separační směsi obsahující hrubý lyzát buněk tří kmenů
Lbc. paracasei a DNA eluované ze dvou druhů magnetických nosičů do TE pufru. Do této separační směsi byly přidávány komponenty v pořadí 1-2-3-4-5. Na gelu bylo analyzováno 20 l DNA.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

chromozomální

DNA

Magnetické nosiče Fkol77ox. (2 mg/ml)		Běh č.	Kmen Lbc. paracasei	Přítomnost chromoz. DNA
	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	1	CCDM 211/06	+
		2	CCDM 212/06	+
		3	CCDM 213/06	+
	DNA eluovaná z nosiče	4	CCDM 211/06	-
		5	CCDM 212/06	-
		6	CCDM 213/06	-

Magnetické nosiče P (HEMA-co-GMA) (2 mg/ml)		Běh č.	Kmen Lbc. paracasei	Přítomnost chromoz. DNA
	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	7	CCDM 211/06	+
		8	CCDM 212/06	+
		9	CCDM 213/06	+
	DNA eluovaná z nosiče	10	CCDM 211/06	-
		11	CCDM 212/06	-
		12	CCDM 213/06	-

+…DNA byla detekována

-….DNA nebyla detekována


Obrázek 8. Agarózová gelová elektroforéza separační směsi obsahující hrubý lyzát buněk tří kmenů Lbc. paracasei a DNA eluované ze dvou druhů magnetických nosičů do TE pufru. Do této separační směsi byly přidávány komponenty v pořadí 1-2-4-3-5. Na gelu bylo analyzováno 20 l DNA.

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Magnetické nosiče Fkol77ox. (2 mg/ml)		Běh č.	Kmen Lbc. paracasei	Přítomnost chromoz. DNA
	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	1	CCDM 211/06	++
		2	CCDM 212/06	++
		3	CCDM 213/06	++
	DNA eluovaná z nosiče	4	CCDM 211/06	+
		5	CCDM 212/06	+
		6	CCDM 213/06	+

Magnetické nosiče P (HEMA-co-GMA) (2 mg/ml)		Běh č.	Kmen Lbc. paracasei	Přítomnost chromoz. DNA
	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	7	CCDM 211/06	++
		8	CCDM 212/06	++
		9	CCDM 213/06	++
	DNA eluovaná z nosiče	10	CCDM 211/06	+
		11	CCDM 212/06	+
		12	CCDM 213/06	+

++…DNA byla detekována zřetelně

+…..DNA byla detekována slabě

-…...DNA nebyla detekována

Obrázek 9. Agarózová gelová elektroforéza separační směsi obsahující hrubý lyzát buněk tří kmenů Lbc. paracasei a DNA eluované ze dvou druhů magnetických nosičů do TE pufru. Do této separační směsi byly přidávány komponenty v pořadí 1-2-4-5-3. Na gelu bylo analyzováno 20 l DNA.

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Magnetické nosiče Fkol77ox. (2 mg/ml)		Běh č.	Kmen Lbc. paracasei	Přítomnost chromoz. DNA
	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	1	CCDM 211/06	+
		2	CCDM 212/06	+
		3	CCDM 213/06	+
	DNA eluovaná z nosiče	4	CCDM 211/06	-
		5	CCDM 212/06	-
		6	CCDM 213/06	-

Magnetické nosiče P (HEMA-co-GMA) (2 mg/ml)		Běh č.	Kmen Lbc. paracasei	Přítomnost chromoz. DNA
	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	7	CCDM 211/06	+
		8	CCDM 212/06	+
		9	CCDM 213/06	+
	DNA eluovaná z nosiče	10	CCDM 211/06	-
		11	CCDM 212/06	-
		12	CCDM 213/06	-

+…DNA byla detekována

-…DNA nebyla detekována

Obrázek 10. Agarózová gelová elektroforéza separační směsi obsahující hrubý lyzát buněk tří kmenů Lbc. paracasei a DNA eluované ze dvou druhů magnetických nosičů do TE pufru. Do této separační směsi byly přidávány komponenty v pořadí 1-2-3-5-4. Na gelu bylo analyzováno 20 l DNA.

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Magnetické nosiče Fkol77ox. (2 mg/ml)		Běh č.	Kmen Lbc. paracasei	Přítomnost chromoz. DNA
	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	1	CCDM 211/06	+
		2	CCDM 212/06	+
		3	CCDM 213/06	+
	DNA eluovaná z nosiče	4	CCDM 211/06	-
		5	CCDM 212/06	-
		6	CCDM 213/06	-

Magnetické nosiče P (HEMA-co-GMA) (2 mg/ml)		Běh č.	Kmen Lbc. paracasei	Přítomnost chromoz. DNA
	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	7	CCDM 211/06	+
		8	CCDM 212/06	+
		9	CCDM 213/06	+
	DNA eluovaná z nosiče	10	CCDM 211/06	-
		11	CCDM 212/06	-
		12	CCDM 213/06	-

+…DNA byla detekována

-…DNA nebyla detekována

1. Shrnutí výsledků izolace DNA pomocí magnetických nosičů s různým pořadím přidávání komponent do separační směsi

Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 6.

Tabulka 6. Shrnutí výsledků izolace DNA pomocí magnetických nosičů s různým pořadím přidávání komponent do separační směsi.

Pořadí smíchávání jednotl. komponent do separač. směsi	Magnetické nosiče (2 mg/ml)		Běh č.	Kmen Lbc. paracasei	Přítomnost chromoz. DNA
1-2-3-4-5	Fkol77ox	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	1	CCDM 211/06	+
			2	CCDM 212/06	+
			3	CCDM 213/06	+
		DNA eluovaná z nosiče	4	CCDM 211/06	-
			5	CCDM 212/06	-
			6	CCDM 213/06	-
	P (HEMA-co-GMA)	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	7	CCDM 211/06	+
			8	CCDM 212/06	+
			9	CCDM 213/06	+
		DNA eluovaná z nosiče	10	CCDM 211/06	-
			11	CCDM 212/06	-
			12	CCDM 213/06	-
1-2-4-3-5	Fkol77ox	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	1	CCDM 211/06	++
			2	CCDM 212/06	++
			3	CCDM 213/06	++
		DNA eluovaná z nosiče	4	CCDM 211/06	+
			5	CCDM 212/06	+
			6	CCDM 213/06	+
	P (HEMA-co-GMA)	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	7	CCDM 211/06	++
			8	CCDM 212/06	++
			9	CCDM 213/06	++
		DNA eluovaná z nosiče	10	CCDM 211/06	+
			11	CCDM 212/06	+
			12	CCDM 213/06	+

Pořadí smíchávání jednotl. komponent do separač. směsi	Magnetické nosiče (2 mg/ml)		Běh č.	Kmen Lbc. paracasei	Přítomnost chromoz. DNA
1-2-4-5-3	Fkol77ox	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	1	CCDM 211/06	+
			2	CCDM 212/06	+
			3	CCDM 213/06	+
		DNA eluovaná z nosiče	4	CCDM 211/06	-
			5	CCDM 212/06	-
			6	CCDM 213/06	-
	P (HEMA-co-GMA)	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	7	CCDM 211/06	+
			8	CCDM 212/06	+
			9	CCDM 213/06	+
		DNA eluovaná z nosiče	10	CCDM 211/06	-
			11	CCDM 212/06	-
			12	CCDM 213/06	-
1-2-3-5-4	Fkol77ox	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	1	CCDM 211/06	+
			2	CCDM 212/06	+
			3	CCDM 213/06	+
		DNA eluovaná z nosiče	4	CCDM 211/06	-
			5	CCDM 212/06	-
			6	CCDM 213/06	-
	P (HEMA-co-GMA)	Separační směs obsahující hrubý lyzát buněk	7	CCDM 211/06	+
			8	CCDM 212/06	+
			9	CCDM 213/06	+
		DNA eluovaná z nosiče	10	CCDM 211/06	-
			11	CCDM 212/06	-
			12	CCDM 213/06	-

 Chromozomální DNA byla detekována ve všech separačních směsích obsahujících hrubý lyzát buněk. DNA eluovaná z magnetických nosičů nebyla na gelu detekována,

s výjimkou smíchávání komponent v pořadí 1-2-4-3-5, tzn. H₂O–NaCl–magnetické nosiče–PEG 6000–hrubý lyzát. Rozdíl mezi magnetickými částicemi nebyl prokázán.

2. Spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA eluované z magnetických nosičů

U všech vzorků DNA vyizolované pomocí magnetických nosičů byla spektrofotometricky změřena absorbance v rozmezí vlnových délek 220–320 nm

a stanovena koncentrace DNA. Množství DNA eluované z magnetických nosičů je uvedeno v Tabulce 7.

Tabulka 7. Spektrofotometrické měření DNA izolované z kmenů druhu Lbc. paracasei pomocí magnetických nosičů Fkol77ox. a P(HEMA-co-GMA) a stanovení její koncentrace.

Pořadí smíchávání jednotl. komponent do separač. směsi	Magnetické nosiče (2 mg/ml)	Kmen Lbc. paracasei	Koncentrace DNA [ng/l]:
1-2-3-4-5	Fkol77ox.	CCDM 211/06	3,35
		CCDM 212/06	2,24
		CCDM 213/06	2,14
	P(HEMA-co-GMA)	CCDM 211/06	7,66
		CCDM 212/06	8,33
		CCDM 213/06	9,04
1-2-4-3-5	Fkol77ox.	CCDM 211/06	16,57
		CCDM 212/06	20,70
		CCDM 213/06	15,46
	P(HEMA-co-GMA)	CCDM 211/06	17,21
		CCDM 212/06	30,61
		CCDM 213/06	21,59
1-2-4-5-3	Fkol77ox.	CCDM 211/06	8,00
		CCDM 212/06	4,30
		CCDM 213/06	7,54
	P(HEMA-co-GMA)	CCDM 211/06	6,09
		CCDM 212/06	5,49
		CCDM 213/06	5,50
1-2-3-5-4	Fkol77ox.	CCDM 211/06	3,67
		CCDM 212/06	3,58
		CCDM 213/06	3,41
	P(HEMA-co-GMA)	CCDM 211/06	1,34
		CCDM 212/06	1,86
		CCDM 213/06	3,70

 DNA eluovaná z nosičů byla v nízké koncentraci (1,34–9,04 ng/l) s výjimkou pořadí 1-2-4-3-5, tzn. H₂O–NaCl–magnetické nosiče–PEG 6000–hrubý lyzát, kdy byla koncentrace znatelně větší (15,46–30,61 ng/l). Rozdíl mezi magnetickými částicemi v daném experimentálním uspořádání nebyl prokázán.

3. Testování amplifikovatelnosti DNA eluované z magnetických nosičů

DNA vyizolovaná pomocí magnetických nosičů byla použita jako matrice

pro rodově specifickou PCR. Výsledky agarózové gelové elektroforézy amplifikovaných PCR produktů jsou uvedeny na Obrázku 11 až 14.
Obrázek 11. Agarózová gelová elektroforéza PCR produktů s rodově specifickými primery. Amplifikovaná byla DNA izolována způsobem, kdy do separační směsi byly přidávány
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
komponenty v pořadí 1-2-3-4-5. Na gelu bylo analyzováno 10 l PCR produktů.


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

■……DNA izolovaná z kmene CCDM 211/06

fenolovou extrakcí, a která byla následně
amplifikována pomocí rodově specifické PCR

▲……DNA izolovaná z kmene CCDM 211/06

pomocí magnetického skla, a která byla
následně amplifikována pomocí rodově
specifické PCR

……DNA standard 100 bp

♦……PCR směs bez DNA matrice

Běh č.:	Kmen Lbc. paracasei	Množství DNA v PCR směsi (ng/l)	Magnetické nosiče/ poznámka	Detekce PCR produktů
1	pozitivní kontrola 1	-	■	+
2	pozitivní kontrola 2	-	▲	+
3	DNA standard	-	
4	CCDM 211/06	3,35	Fkol77ox.	+
5	CCDM 212/06	2,24		+
6	CCDM 213/06	2,14		+
7	CCDM 211/06	7,66	P(HEMA-co-GMA)	+
8	CCDM 212/06	8,33		+
9	CCDM 213/06	9,04		+
10	negativní kontrola	-	♦	-

O
1 2 3 4 5 6 7 8
brázek 12. Agarózová gelová elektroforéza PCR produktů s rodově specifickými primery. Amplifikovaná byla DNA izolována způsobem, kdy do separační směsi byly přidávány komponenty v pořadí 1-2-4-3-5. Na gelu bylo analyzováno 10 l PCR produktů.

1 2 3 4 5 6 7 8

+……­DNA byla detekována

-…….DNA nebyla detekována

……DNA standard 100 bp

♦……PCR směs bez DNA matrice

Běh č.:	Kmen Lbc. paracasei	Množství DNA v PCR směsi (ng/l)	Magnetické nosiče/ poznámka	Detekce PCR produktů
1	DNA standard	-	
2	CCDM 211/06	16,57	Fkol77ox.	+
3	CCDM 212/06	20,70		+
4	CCDM 213/06	15,46		+
5	CCDM 211/06	17,21	P(HEMA-co-GMA)	+
6	CCDM 212/06	30,61		+
7	CCDM 213/06	21,59		+
8	negativní kontrola	-	♦	-

O
1 2 3 4 5 6 7 8
brázek 13. Agarózová gelová elektroforéza PCR produktů s rodově specifickými primery. Amplifikovaná byla DNA izolována způsobem, kdy do separační směsi byly přidávány komponenty v pořadí 1-2-4-5-3. Na gelu bylo analyzováno 10 l PCR produktů.

1 2 3 4 5 6 7 8

+……­DNA byla detekována

-…….DNA nebyla detekována

……DNA standard 100 bp

♦……PCR směs bez DNA matrice

Běh č.:	Kmen Lbc. paracasei	Množství DNA v PCR směsi (ng/l)	Magnetické nosiče/ poznámka	Detekce PCR produktů
1	DNA standard	-	
2	CCDM 211/06	8,00	Fkol77ox.	+
3	CCDM 212/06	4,30		+
4	CCDM 213/06	7,54		+
5	CCDM 211/06	6,09	P(HEMA-co-GMA)	+
6	CCDM 212/06	5,49		+
7	CCDM 213/06	5,50		+
8	negativní kontrola	-	♦	-

1 2 3 4 5 6 7 8

O
1 2 3 4 5 6 7 8
brázek 14. Agarózová gelová elektroforéza PCR produktů s rodově specifickými primery. Amplifikovaná byla DNA izolována způsobem, kdy do separační směsi byly přidávány komponenty v pořadí 1-2-3-5-4. Na gelu bylo analyzováno 10 l PCR produktů.


1 2 3 4 5 6 7 8

+……­DNA byla detekována

-…….DNA nebyla detekována

……DNA standard 100 bp

♦……PCR směs bez DNA matrice

Běh č.:	Kmen Lbc. paracasei	Množství DNA v PCR směsi (ng/l)	Magnetické nosiče/ poznámka	Detekce PCR produktů
1	DNA standard	-	
2	CCDM 211/06	3,67	Fkol77ox.	+
3	CCDM 212/06	3,58		+
4	CCDM 213/06	3,41		+
5	CCDM 211/06	1,34	P(HEMA-co-GMA)	+
6	CCDM 212/06	1,86		+
7	CCDM 213/06	3,70		+
8	negativní kontrola	-	♦	-

 DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů se amplifikovala ve všech případech. Nejintenzivnější PCR produkty byly detekovány v eluátech, co obsahovaly nejvíce DNA (Obrázek 12). Rozdíl mezi magnetickými částicemi nebyl prokázán.

6. Selektivní separace biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů s navázaným streptavidinem

1. Příprava biotinylovaných PCR produktů

Byla provedena PCR s primerem LbLMA1-rev a biotinylovaným primerem

R16-1 podle kapitoly 3.5.6. Detekce biotinylovaného PCR produktu byla provedena pomocí agarózové gelové elektroforézy (Obrázek 15).
O
1 2 3 4 5
brázek 15. Agarózová gelová elektroforéza biotinylovaných PCR produktů s rodově specifickými primery. Na gelu bylo analyzováno 10 l PCR produktů.

Běh č.:	Kmen Lbc. paracasei	Množství DNA v PCR směsi (ng/l)	Detekce PCR produktů
1	DNA standard	-
2	CCDM 211/06	10	+
3	CCDM 212/06	10	+
4	CCDM 213/06	10	+
5	negativní kontrola	-	-

+……­DNA byla detekována

-…….DNA nebyla detekována

 Na agarózovém gelu byly detekovány specifické PCR produkty po amplifikaci s biotinylovaným primerem.

2. Izolace nepřečištěných biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů PGMA-NH₂-STV

Dle kapitoly 3.5.8.5. byla stanovena přibližná koncentrace zásobního roztoku

s magnetickými částicemi PGMA-NH₂-STV. Tato koncentrace vyšla 19,1 mg/ml.
Biotinylované amplikony byly přidány k magnetickým nosičům dle kapitoly 3.5.8.5. Současně byla testována vazba biotinylovaných PCR produktů na magnetické nosiče PGMA-NH₂-STV a uvolnění těchto PCR produktů z nosičů (Obrázek 16).

Běh č.:	Lactobacillus paracasei kmen CCDM 211/06	Detekce DNA
1	DNA standard	
2	Biotinylovaný PCR produkt	+
Magnetické nosiče 1 ředěny v PBS pufru
3	2´ ředěný biotinylovaný PCR produkt	+
4	PCR produkty v supernatantu po odseparování magnetického nosiče s navázanými PCR produkty	+
5	PCR produkty uvolněné z magnetických částic	-
Magnetické nosiče 2 ředěny v PBS pufru
6	2´ ředěný biotinylovaný PCR produkt	+
7	PCR produkty v supernatantu po odseparování magnetického nosiče s navázanými PCR produkty	+
8	PCR produkty uvolněné z magnetických částic	-
Magnetické nosiče 4 ředěny v PBS pufru
9	2´ ředěný biotinylovaný PCR produkt	+
10	PCR produkty v supernatantu po odseparování magnetického nosiče s navázanými PCR produkty	+
11	PCR produkty uvolněné z magnetických částic	-

Obrázek 16. Agarózová gelová elektroforéza biotinylovaných PCR produktů (nepřečištěných) před a po separaci pomocí magnetických nosičů PGMA-NH₂-STV. Na gelu bylo analyzováno 20 l PCR produktů.


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

+…DNA byla detekována

-….DNA nebyla detekována

…DNA standard 100 bp

 Po magnetické separaci nedošlo k detekovatelnému úbytku biotinylovaných PCR produktů v supernatantu, a zároveň nebyla detekována jejich eluce z magnetických nosičů.

3. Izolace nepřečištěných biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů MPG^ Streptavidin

Jako kontrola byly použity komerční magnetické nosiče MPG^ Streptavidin (Obrázek 17).

Obrázek 17. Agarózová gelová elektroforéza biotinylovaných PCR produktů (nepřečištěných) před a po separaci pomocí magnetických nosičů MPG^ Streptavidin. Na gelu bylo analyzováno 20 l PCR produktů.

Běh č.:	Kmen Lactobacillus paracasei	Detekce DNA
1	DNA standard	
CCDM 211/06
2	Biotinylovaný PCR produkt	+++
3	2´ ředěný biotinylovaný PCR produkt	+++
4	PCR produkty v supernatantu po odseparování magnetického nosiče s navázanými PCR produkty	++
5	PCR produkty uvolněné z magnetických částic	+
CCDM 212/06
6	Biotinylovaný PCR produkt	+++
7	2´ ředěný biotinylovaný PCR produkt	+++
8	PCR produkty v supernatantu po odseparování magnetického nosiče s navázanými PCR produkty	+
9	PCR produkty uvolněné z magnetických částic	+
CCDM 213/06
10	Biotinylovaný PCR produkt	+++
11	2´ ředěný biotinylovaný PCR produkt	+++
12	PCR produkty v supernatantu po odseparování magnetického nosiče s navázanými PCR produkty	+
13	PCR produkty uvolněné z magnetických částic	+

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

+++..PCR produkt detekován silně

++…PCR produkt detekován zřetelně

+…..PCR produkt detekován slabě

-…...PCR produkt nedetekován

*…..DNA standard 100 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

 Po magnetické separaci se na nosiče navázala část biotinylovaných PCR produktů (hodně jich zůstalo v supernatantu). Biotinylované PCR produkty se z těchto nosičů v menším množství eluovaly do PCR vody.

4. Přečišťování biotinylovaných PCR produktů

Nejprve bylo testováno přečištění PCR produktů metodou reverzní imobilizace DNA na pevnou fázi (dle kapitoly 3.5.8.2), pomocí fenolové extrakce (dle kapitoly 3.5.8.3) a nakonec pomocí komerčního kitu (dle kapitoly 3.5.8.4). Kvalita přečištěného biotinylovaného PCR produktu byla ověřena pomocí agarózové gelové elektroforézy; výsledek je uveden na Obrázku 18 až 20.

Obrázek 18. Agarózová gelová elektroforéza biotinylovaného PCR produktu přečištěného metodou SPRI. Na gelu bylo analyzováno 20 l PCR produktů.

1 2 3

Běh č.:	Kmen Lbc. paracasei CCDM 211/06	Detekce DNA
1	DNA standard	
2	PCR produkt nepřečištěný pomocí SPRI	+
3	PCR produkt přečištěný pomocí SPRI	-

+……­DNA byla detekována

-…….DNA nebyla detekována

……DNA standard 100 bp

Obrázek 19. Agarózová gelová elektroforéza biotinylovaných PCR produktů přečištěných pomocí fenolové extrakce. Na gelu bylo analyzováno 20 l PCR produktů.

1 2 3 4

Běh č.:	Kmen Lbc. paracasei	Detekce DNA
1	DNA standard	
2	CCDM 211/06	+
3	CCDM 212/06	+
4	CCDM 213/06	+

++…PCR produkt detekován zřetelně

+…..PCR produkt detekován slabě

-…...DNA nebyla detekována

…..DNA standard 100 bp
Obrázek 20. Agarózová gelová elektroforéza biotinylovaných PCR produktů přečištěných pomocí PCR purifikačního kitu QIAquick. Na gelu bylo analyzováno 20 l PCR produktů.

Běh č.:	Kmen Lbc. paracasei	Detekce DNA
1	DNA standard	
2	CCDM 211/06	++
3	CCDM 212/06	++
4	CCDM 212/06	++

1 2 3 4

++…..PCR produkt detekován zřetelně

+……PCR produkt detekován slabě

-…….DNA nebyla detekována

……DNA standard 100 bp
 Přečištěné biotinylované PCR produkty pomocí magnetického nosiče Fkol77ox
a fenolovou extrakcí nebyly v dostatečné koncentraci pro následnou separaci pomocí magnetických nosičů s navázaným streptavidinem. Dostatečného množství amplikonů bylo dosaženo přečištěním PCR produktů pomocí PCR purifikačního kitu QIAquick.

5. Izolace přečištěných biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů PGMA-NH₂-STV

Takto přečištěné biotinylované amplikony byly přidány k magnetickým nosičům PGMA-NH₂-STV dle kapitoly 3.5.8.5. Byla testována vazba těchto PCR produktů

na nosiče a jejich následná eluce do PCR vody. Výsledek agarózové gelové elektroforézy je znázorněn na Obrázku 21.
Obrázek 21. Agarózová gelová elektroforéza biotinylovaných PCR produktů (přečištěných) před a po separaci pomocí magnetických nosičů PGMA-NH₂-STV. Na gelu bylo analyzováno 20 l PCR produktů.


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Běh č.:	Lactobacillus paracasei kmen CCDM 211/06	Detekce DNA
1	DNA standard	
2	Biotinylovaný PCR produkt	+
Magnetické nosiče 1 ředěny v PBS pufru
3	2´ ředěný biotinylovaný PCR produkt	+
4	PCR produkty v supernatantu po odseparování magnetického nosiče s navázanými PCR produkty	+
5	PCR produkty uvolněné z magnetických částic	-
Magnetické nosiče 2 ředěny v PBS pufru
6	2´ ředěný biotinylovaný PCR produkt	+
7	PCR produkty v supernatantu po odseparování magnetického nosiče s navázanými PCR produkty	+
8	PCR produkty uvolněné z magnetických částic	-
Magnetické nosiče 4 ředěny v PBS pufru
9	2´ ředěný biotinylovaný PCR produkt	+
10	PCR produkty v supernatantu po odseparování magnetického nosiče s navázanými PCR produkty	+
11	PCR produkty uvolněné z magnetických částic	-

+…DNA byla detekována

-….DNA nebyla detekována

…DNA standard 100 bp

 Po magnetické separaci nedošlo k detekovatelnému úbytku biotinylovaných PCR produktů v supernatantu, a zároveň nebyla detekována jejich eluce z magnetických nosičů.

6. Izolace přečištěných biotinylovaných PCR produktů pomocí magnetických nosičů MPG^ Streptavidin

Jako kontrola byly použity komerční magnetické nosiče MPG^ Streptavidin. Výsledek agarózové gelové elektroforézy je znázorněn na Obrázku 22.

Obrázek 22. Agarózová gelová elektroforéza biotinylovaných PCR produktů (přečištěných) před a po separaci pomocí komerčně dostupných magnetických nosičů. Na gelu bylo analyzováno 20 l PCR produktů.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Běh č.:	Kmen Lactobacillus paracasei	Detekce DNA
1	DNA standard	
CCDM 211/06
2	Biotinylovaný PCR produkt	+++
3	2´ ředěný biotinylovaný PCR produkt	+++
4	PCR produkty v supernatantu po odseparování magnetického nosiče s navázanými PCR produkty	++
5	PCR produkty uvolněné z magnetických částic	+
CCDM 212/06
6	Biotinylovaný PCR produkt	+++
7	2´ ředěný biotinylovaný PCR produkt	+++
8	PCR produkty v supernatantu po odseparování magnetického nosiče s navázanými PCR produkty	+
9	PCR produkty uvolněné z magnetických částic	+
CCDM 213/06
10	Biotinylovaný PCR produkt	+++
11	2´ ředěný biotinylovaný PCR produkt	+++
12	PCR produkty v supernatantu po odseparování magnetického nosiče s navázanými PCR produkty	+
13	PCR produkty uvolněné z magnetických částic	+

+++..PCR produkt detekován silně

++…PCR produkt detekován zřetelně

+…..PCR produkt detekován slabě

-…...PCR produkt nedetekován

*…..DNA standard 100 bp

 Po magnetické separaci se na nosiče navázala část biotinylovaných PCR produktů a ty se rovněž z  těchto nosičů eluovaly do PCR vody.