Karimova shoira mikrobiologiya va immunologiya, virusologiya

Uslubiy ko‘rsatmalar.

T va V limfotsitlarga baho berishda tekshiruv ob’ekti limfotsitlar hisoblanadi. SHuning uchun limfotsitlarni toza populyasiyasini ajratib olish muhim ahamiyatga ega.
Limfotsitlarni fikol-verografin zichligi gradientida ajratib olish.

1. 
   Tekshirish uchun tirsak venasidan qon (2-5 ml), ivib qolmasligi uchun geparin (25 birl/ml) qo‘shilgan probirkaga olinadi. Olingan geparinli qonni 199 muhitda 2-3 marotaba suyultirish mumkin.
   
2. 
   Geparinli qon probirkaga olingan (1-1,5 ml) fikoll-verografin zichligi gradientiga (1,077) sekin asta probirka devori bo‘ylab qatlamlashtiriladi. Gradient zichlik bilan qon o‘rtasidagi nisbat 1:3 teng bo‘lishi kerak.
   
3. 
   Probirka 1500 ayln/min 30 minut sentrifuga qilinadi. 4. Halqa hosil qilib interfazada qolgan limfotsitlarni paster pipetkasi bilan linib ikki marotaba 199 muhitida 800 ayln/min 10 min sentrifugada yuviladi.
   

Limfotsitlar Goryaev kamerasida sanaladi va ularning konsentratsiyasi 1 ml da 2 mln. hujayraga etkaziladi.
Limfotsitlarni ishlatishdan oldin ularni yashash faoliyati o‘rganiladi. Buning uchun limfotsit suspenziyasi Paster pipetkasida buyum oynasiga bir tomchi olinib, uning ustiga 1% tripan ko‘kini eritmasi tomiziladi va ustiga yopqich oynacha qo‘yilib 2-3 minutdan keyin mikroskopda limfotsitlar 100 tagacha sanalib chiqiladi (o‘lgan limfotsitlar ko‘k rangga bo‘yaladi). Tirik limfotsitlar 95% kam bo‘lmasligi kerak.

T-limfotsitlarni qo‘y eritrotsitlari bilan E-rozetka hosil qilish usuli yordamida aniqlash.

1. 
   0.1 ml limfotsit aralashmasiga 0.1 ml 1% qo‘y eritrotsitlari qo‘shiladi, aralashma 5 minut 37⁰C termostatga qo‘yiladi, so‘nga 800 aylan/min 5 minut sentrifuga qilinadi va 0-4⁰C muzlatkichda 30-60 minut saqlandi.
   
2. 
   CHo‘kmaning ustki qismidagi suyuqlik paster pipetkasi bilan sekin so‘rilib tashlanadi, aralashma o‘ta ehtiyotkorlik bilan probirkada aralashtiriladi va 2,5% sovutilgan glyutar-aldegid qo‘shiladi, yani oxirgi
   

konsentratsiyasi 0,6% bo‘lguncha. Xona temperaturasida 10 minut saqlanadi.

3. 
   CHo‘kmadan preparat - surtma tayyorlanib, metil spirtida 10 minut fiksatsiya qilinadi. Surtma Romanovkiy - Gimza usulida bo‘yaladi.
   
4. 
   Surtma yorug‘lik mikroskopida (immersion) ko‘riladi, 100-200 tagacha limfotsitlar sanaladi. Rozetka hosil qiluvchi T limfotsit deb uchta va undan ortiq qo‘y eritrotsitlarni o‘ziga biriktirib olgan limfotsitlarga aytiladi. Sog‘lom odamlarda T- limfotsitlarning bu populyasiyasi 50 - 70 foizni tashkil qiladi.