Masarykova univerzita přírodovědecká fakulta

2Praktická část

2.1Materiál

Mléko na výrobu jogurtů bylo získáno od osmi dojnic (kříženky plemen Českého strakatého a Holštýnského skotu), které byly rozděleny do dvou skupin s podobnou produkcí mléka. Zvířata byla krmena dvakrát denně libovolným množstvím krmiva skládajícího se z kukuřičné siláže, lučního sena a doplňkové směsi. Kontrolní skupina dojnic (K) dostávala pouze základní krmivo, díky kterému byl denní příjem isoflavonů rovem 8401,01 mg. Pokusná skupina (P) dostávala základní krmivo a navíc 12,5 g 40 % sójového extraktu (Biomedica spol. s.r.o.), který byl přidán při každém krmení. Z celkového obsahu isoflavinů v sójovém extraktu připadalo na daidzein 93 %, genistein 6 % a glycitein 1%. U dojnic krmených směsí obohacenou o sójový extrakt byl denní příjem isoflavonů v potravě skoro dvojnásobný 16006.55 mg, oproti skupině kontrolní.

V rámci bakalářské práce byly stanoveny hladiny equolu a isoflavonů v osmi vzorcích jogurtů. Vzorky byl rozděleny na dvě skupiny, první skupina (P1, P2, P3, P4) byla vyrobena z mléka experimentálních krav a skupina druhá z mléka krav kontrolních, vzorky K1, K2, K3 a K4 . Každý vzorek jogurtu byl připraven v triplice A, B, C a následně byl dvakrát měřen na MS – TOF.

2.2Metody

Odstranění bílkovin

Do 15 ml centrifugační zkumavky byly napipetovány 3 ml rozmraženého protřepáním dobře homogenizovaného vzorku jogurtu. Dále bylo přidáno 6 ml acetonu a 100 µl vnitřního standardu 4-hydroxybenzofenonu (4-HBP) o koncentraci 1 µg/ml. Směs byla následně 3 minuty třepána na vortexu a dále centrifugována při 11000 x g po dobu dvaceti minut (Eppendorf centrifuge 5804 R; rotor GL104). Poté byla veškerá kapalina převedena do 25 ml srdcové baňky. Nakonec byla veškerá tekutina odpařena na vakuové odparce (RVO 004 INGOS).

Enzymová hydrolýza

K odparku byly přidány 3 ml acetátového pufru (74mM, pH 5) a 100 µl β-glukuronidasy (Helix pomatia, Sigma-Aldrich). Následně byla směs inkubována (N-BIOTECH NB-205) při 37°C přes noc.

Extrakce vzorku

Enzymový hydrolyzát byl převeden do 15-ml centrifugační zkumavky a k němu byly přidány 3 ml ethylacetátu. Následně byla směs protřepána 3 minuty na vortexu a centrifugována pět minut při 11000 x g (Eppendorf centrifuge 5804 R; rotor GL104). Horní organický podíl byl odebrán do nové 15-ml centrifugační zkumavky. Poté byly do původní zkumavky přidány opět 3 ml ethylacetátu a opakován výše zmíněný postup. Spojené organické podíly byly následně uloženy na patnáct minut do mrazáku -70°C a dále byly centrifugovány pět minut při 0°C a 11000 x g (Eppendorf centrifuge 5804 R; rotor GL104). Nakonec byla do 25 ml srdcových baněk odebrána horní vrstva (bez tuku) a odpařena na rotační vakuové odparce (RVO 004 INGOS) do sucha.

Příprava vzorku na analýzu HPLC-MS

K odparku byl přidán 1 ml 50% methanolu a vložen na patnáct minut do ultrazvuku (Branson 5510 Ultrasonic Cleaner). Vzorek byl dále převeden do 1,5-ml zkumavek od firmy Eppendorf a centrifugován pět minut při 11000 x g (eppendorf). Následně byl vzorek přefiltrován do vialek pomocí stříkačkových mikrofiltrů (0,20 µm, Labicom), profouknut dusíkem a analyzován pomocí HPLC-MS-TOF.

2.3HPLC-MS-TOF analýza

Vzorky byly separovány pomocí HPLC s použitím kolony Zorbax Extend -C18 (50 x 2,1 mm; 1,7 µm) s příslušnou předkolonou a filtrem pro zachycení případných nečistot (0,22 µm). Kolona byla temperována na teplotu 35 °C. Složení mobilní fáze:

• 
  A = 0,1 % kyselin octová v H₂O
  
• 
  B = methanol
  

Tabulka VI - Složení mobilní fáze při analýze HPLC-MS-TOF

Čas (min)	A (%)	B (%)
0	75	25
6	55	45
6,01	50	50
12,01	0	100
17	0	100

Látky byly detekovány a kvantifikovány pomocí hmotnostního spektrometru s detektorem doby letu MS-TOF Agilent 6224 za užití parametrů uvedených v Tabulce 5. Získaná data byla vyhodnocena pomocí programu Mass Hunter.

Tabulka VII – Parametry nastavení MS – ES - detektroru

Ionizátor	ESI-
Teplota plynu	325 °C
Sušící plyn	101/min
Tlak na zmlžovači	35 psig
Napětí na kapiláře	4000 V
Napětí na děliči	150 V
Napětí na sběrači	65 V
OCT 1 RF Vpp	750 V

Pro HPLC-MS analýzu byly použity komerční standardy daidzeinu (1), glyciteinu (2), equolu (3), genisteinu (4) a vnitřní standard 4-HBP (5).

Statistické zpracování výsledků bylo provedeno t-testem.