Masarykova univerzita přírodovědecká fakulta

OBSAH

1Teoretická část 9

1.1 Fytoestrogeny 9

1.1.1Lignany 9

1.1.2Stilbeny 10

1.1.3Kumestany 10

1.1.4Isoflavony 11

1.2 Funkční potraviny 17

1.2.1Zdravotní účinky funkčních potravin 19

1.2.2Základní funkční potraviny 19

1.3 Jogurt 22

1.3.1Technologické postupy výroby jogurtů 22

1.3.2Složení jogurtů 23

2Praktická část 26

2.1Materiál 26

2.2Metody 26

2.3HPLC-MS-TOF analýza 27

2.4Výsledky a diskuze 29

2.4.1Chromatogramy 29

2.4.2MS spektra 30

2.4.3Hladiny v jogurtech 31

3Závěr 35

4Seznam zkratek 36

5 Zdroje 37

1Teoretická část

1.1 Fytoestrogeny

Fytoestrogeny jsou rostlinné nesteroidní látky estrogenní povahy, jelikož jsou svojí strukturou podobné savčímu hormonu 17β - estradiolu. Tato podobnost s estrogeny umožňuje některým fytoestrogenům navázat se na estrogenové receptory alfa a beta (dále jen ERα, ERβ) a tím vyvolat estrogenní nebo antiestrogenní účinky. [1][2]

Fytoestrogeny mohou být na základě jejich chemické struktury děleny na čtyři hlavní skupiny: isoflavonoidy, flavonoidy, stilbeny a lignany. Isoflavonidy se dále člení na isoflavony a kumestaty, zatímco flavonoidy se dále dělí na flavony, flavanony a chalkony. Některé terpenoidy a saponiny se také řadí do fytoestrogenů. Do teoretického úvodu jsem vybral čtyři skupiny: lignany, stilbeny, kumestaty a isoflavony, které podrobněji popíšu. [34]

1.1.1Lignany

Jedná se o skupinu látek rozmanité struktury, jejichž základem jsou dvě fenylpropanoidové jednotky. V rostlinách se nachází v estrogenně neaktivní formě prekurzorů, mezi které patří pinoresinol, matairesinol a secoisolariciresinol (obrázek 1). K jejich aktivaci dochází působením bakterií střevní flóry. Prekurzory lignanů můžeme najít v široké škále potravin, například v sezamovém semínku, luštěninách, celozrnných výrobcích, zelenině nebo ovoci. Nejbohatším zdrojem prekurzoru seco-isolarciresinolu je lněné semínko. Mezi dva hlavní enterolignany se řadí enterdiol a enterolakton, u kterých se zkoumá jejich vliv na snížení rizika rakoviny a kardiovaskulárních onemocnění. [4][5][6]


Obrázek 1 - seco-isolarciresinol

1.1.2Stilbeny

Stilbeny jsou malá skupina sekundárních metabolitů, které vznikají fenylpropanovou cestou a jsou produkovány v řadě nepříbuzných rostlin.[28] Hlavním zdrojem stilbenů je resveratrol, který se nachází v červeném víně a arašídech. Existují dva isomery resveratrolu , cis (obrázek 2) a trans (obrázek 3) forma, ale pouze trans forma je estrogenně aktivní. Množství resveratrolu ve víně závisí na vícero faktorech, jako například na lokaci, času sklizně a délce kvašení. [3] Jelikož se resveratrol nachází převážně ve slupce, bílé víno vyráběné kvašením oloupaných hroznů obsahuje velice malé množství resveratrolu, oproti vínu červenému, které se dělá z celých hroznů.


Obrázek 3 - trans resveratrol

Obrázek 2 - cis resveratrol

Resveratrol přispívá k antioxidačnímu potenciálu červeného vína a tím může hrát významnou roli v prevenci kardiovaskulárních onemocnění. Bylo dokázáno, že dokáže ovlivnit metabolismus lipidů a inhibuje oxidaci lipopoproteinů s nízkou hustotou (LDL) a shlukování krevních destiček. Resveratrol má také protizánětlivé účinky.[7]

1.1.3Kumestany

Kumestany jsou další skupinou látek, které vykazují estrogenní aktivitu. Nejvýznamnějšími kumestany s fytoestrogenním efektem jsou kumestrol (obrázek 4) a 4´-methoxykumestrol (obrázek 5). Kumestrol byl poprvé izolován v padesátých letech z jetele. Kumestrol má vyšší vazebnou afinitu k ERβ než většina fytoestrogenů a v laboratorních podmínkách bylo sledováno, že dokáže inhibovat resorpci kostí a stimulovat jejich mineralizaci.
Hlavním zdrojem této látky jsou klíčky jetele a tolice vojtěšky, přitom obsah kumestrolu je 5,6 respektive 0,7 mg na gram sušiny. Hrách, fazol měsíční a sójové klíčky také obsahují kumestrol, ale pouze v malém množství (15–80 μg na gram sušiny). [1][8]




Obrázek 5 - 4´-methoxykumestrol

Obrázek 4 - Kumestrol

1.1.4Isoflavony

Isoflavony jsou nejvíce probádanou skupinou fytoestrogenů. Díky podobné chemické struktuře jako je 17-β-estradiol jsou některé isoflavony schopny se vázat na ERα, ERβ a tím vykazují estrogenní aktivitu. Díky schopnosti se navázat na ER mají isoflavony možnost ovlivnit vnitrobuněčné signální mechanismy. [3] Jejich vazebná afinita je vyšší k ERβ než ERα a odhaduje se, že je stokrát až desettisíckrát menší než afinita estradiolu, nicméně jejich hladina v krvi může být desettisíckrát větší než koncentrace estrogenních hormonů.[9]

Funkce isoflavonů se liší podle toho, na který ER působí. ERα a ERβ se nacházejí v rozdílných koncentracích v různých orgánech a typech buněk. Přítomnost ERα byla zaznamenána v tkáních, kde působí estrogen, což jsou prsa, vaječníky, děloha, varlata, hypotalamus/hypofýza a játra. ERβ byl nalezen hlavně v prostatě, ledvinách, močovém měchýři, plicích, kostech, oběhovém systému včetně srdce, krevních buňkách, brzlíku a střevech. [10]

Obrázek 6 – Metabolismus isoflavonů - upraveno a převzato z CEDERROTH, Christopher R. a Serge NEF. Soy, phytoestrogens and metabolism: A review.strogens and metabolism: A review.
Můžeme je rozčlenit na isoflavony s glykosidickou skupinou, kam spadají daidzin, genistin, glycitin a dále na látky, které glykosidickou skupinu postrádají (aglykony) – daidzein, genistein a glycitein (obrázek 6). [8]

V rostlinách se nejčastěji vyskytují glykosylované formy isoflavonů, které jsou ovšem biologicky neaktivní. Svoji aktivitu získají až poté, co jsou hydrolyzovány bakteriemi v dutině břišní na aglykony. Daidzein může být dále metabolizován na equol a P-desmethylangolensin a genistein na p-ethyl fenol. [11]

Isoflavony se nacházejí téměř výlučně v luštěninách, především sójové boby a výrobky z sóji slouží jako nejčastější zdroj. Analýzy sójových výrobků ukázaly, že většina obsahuje 0,1 – 3,0 mg/g. S obsahem isoflavonů 20 mg/g jsou sójové klíčky jedním z nejbohatších zdrojů (tabulka 1). [12]
Tabulka I - koncetrace isoflavonů v mg na 100 mg potraviny

Produkt	Celková koncentrace	Daidzein	Genistein
Sójové boby	128,34	46,46	73,76
Sójová mouka	177,89	71,19	96,83
Natto	58,93	21,85	29,04
Miso	42,55	16,13	24,56
Tempeh	43,52	17,59	24,85
Tofu	22,70	8,00	12,75
Sójové mléko	9,65	4,45	6,06

Zdroj: http://www.isoflavones.info/isoflavones-content.php

V Asii je velice oblíbená strava bohatá na sóju a tím pádem obsahuje velké množství isoflavonů, které s největší pravděpodobností přispívají ke sníženému výskytu hormonálně závislých nemocí, kardiovaskulárních chorob, rakovin prsu, prostaty a tlustého střeva a také pomáhají při symptomech menopauzy. Míra výskytu rakoviny prsu v Asijských zemích je o třetinu až polovinu menší než u europoidních žen a četnost menopauzálních návalů horka je u asijských žen nižší než u žen ze západních zemí. [14]

Genistein

5,7-Dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)chromen-4-on

Genistein (obrázek 7) byl izolován v roce 1899 vědci Perkinem a Newburym z kručinky barvířské (Genista tinctoria), které vděčí za svůj název. Genistein je v tělě přeměněn na dihydroxygenistein, dále metabolizován na 6-hydroxy-O-DMA(6-hydroxy-O-esmethylangolensin) a nakonec degradován na 4-hydroxyphenyl-2-propionovou. [18]

Studie ukázaly, že genistein zvyšuje osteoblastickou formaci a také snižuje produkci osteoklastů. Dále má schopnost inhibovat proliferaci nádorových a rakovinných buněk, zejména u rakoviny prsu a prostaty. [19]

Obrázek 7 - Genistein


Glycitein

7-Hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-6-methoxy-4-chromenon

Glycitein (obrázek 8) tvoří 5-10 % obsahu isoflavonů ve výrobcích ze sóji a až 40 % v některých sójových doplňcích vyrobených z klíčků. [20]




Obrázek 8 - Glycitein

Přestože se na základě testů na myších ukázalo, že glycitein má vyšší estrogenní aktivitu než genistein, nebyl metabolismus glyciteinu dosud podrobně zkoumán, pravděpodobně z důvodu jeho malé koncentrace v sójových potravinách. [21]

Pozorování naznačují, že prvním krokem v metabolismu glyciteinu je redukce na dihydroglycitein, který poté může podstoupit tři různé cesty. Dihydroglycitein může být dále metabolizován na 5-O-methyl-Odesmethylangolensin, 6-O-methyl-equol a dihydro-6,7,4-trihydroxyisoflavone. [33]

Daidzein

7-Hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl) chromen-4-on

Jak už bylo zmíněno výše, daidzein (obrázek 9) je jeden z nejvíce zastoupených isoflavonů v luštěninách, zejména v sójových bobech, kde se nalézá ve své glykosidické formě. Až po oddělení cukerné složky pomocí bakteriální β-glucosidasy, je aglykovaná forma schopna projít přes střevní epitel nebo být dále metabolizována.

Díky střevní mikroflóře se daidzein přemění na dihydroxydaidzein a dále může být metabolizován na O-DMA (O-demethylangolensin) a equol. [20] Studie ukázaly, že okolo 80-90 % populace dokáže přeměnit daidzein na O-DMA, zatímco pouze 30-50 % populace dokáže produkovat equol.

Střevní bakterie hrají zásadní roli v přeměně daidzeinu. Zvířata, kterým chybí střevní bakterie, nebo mladí jedinci s málo vyvinutou střevní mikroflórou, nedokáží produkovat equol nebo O-DMA. Equol a O-DMA jsou pravděpodobně produkovány jiným druhem bakterií, jelikož někteří jedinci, kteří umí přeměnit daidzein na equol, neumí vyprodukovat O-DMA a naopak. [26]




Obrázek 9 - Daidzein


Equol

[7-hydroxy-3-(4′-hydroxyphenyl)-chroman]

Equol (obrázek 10) je jedním z nejvýznamnějších zástupců isoflavonů, který vzniká působením střevní mikroflóry z daidzeinu. Je schopen se vázat na  ERα i ERβ a tím je estrogenně aktivní. Díky absenci dvojné vazby na heterocyklickém kruhu se na rozdíl od daidzeinu a genisteinu jedná o chirální molekulu, která existuje v dvou enantiomerech S – (-) - equol a R - (+) – equol. Lidské střevní bakterie výlučně produkují S – Equol. Obě formy mají vyšší afinitu k ER, než jejich prekurzor daidzein. [13][14][15]


Obrázek 10 - Equol

Jakmile dojde k jeho vytvoření, je v organismu relativně stabilní. Jak už bylo výše uvedeno, pouze 30 – 50% populace dokáže přeměnit daidzein na equol. Těmto jedincům se říká equol producenti a vyšší procento těchto lidí žije v Asijských zemích. [16][17]

Nejvyšší účinek isoflavonů je pozorován u equol producentů, u kterých je nižší riziko výskytu rakoviny prsu a u žen po menopauze se sleduje nižší úbytek kostní hmoty než u jedinců, kteří equol neumí produkovat. Analýzy také naznačují zlepšení hladiny lipidů (snížení LDL cholesterolu) v krvi při sójové dietě, zejména u equol producentů. [33]

Díky absenci dvojné vazby je equol lepší antioxidant než daidzein. V laboratorních testech bylo zjištěno, že má vyšší antioxidační aktivitu než vitamín C a E.

Hladiny isoflavonů v mléce

Bylo provedeno několik studií zabývajících se hladinou isoflavonů v mléce. Uvedeny jsou dvě, které se zkoumají obsah isoflavonů (Tabulka 2) v mléce dojnic krmených normálním krmivem a krmivem obohaceným o sóju.

Tabulka II - Koncentrace isoflavonů mléce dojnic krmených normálním krmivem a krmivem obohaceným o sóju – údaje v závorkách představují průměrnou hodnotu

	Třináctý a kol.; 2009		Krajčová a kol.; 2010
Krmení	Normální krmivo	Sójové krmivo	Normální krmivo	Sójové krmivo
Daidzein [ng/ml]	12,5	15,6	10-16 (12,8)	13-19 (15,8)
Genistein [ng/ml] [ng/ml]	34,4	37,3	16-57 (35)	18– 9 (37,5)
Equol [ng/ml]	3,5	54,8	3-4 (3,5)	38-76 (55,5)

Hladina Isoflavonů v závislosti na tepelné úpravě

Ačkoli změny obsahu isoflavonů během technologické úpravy sójových výrobků jsou podrobně studovány, studie zaměřené na změnu hladiny isoflanů, zejména equolu, během technologického zpracování kravského mléka jsou vzácné.

Obecně je uznáváno, že isoflavony nejsou ničeny tepelným zpracováním, ale spíše v takovém případě probíhá přeměna mezi jednotlivými formami. Studie (Křížová, 2011) udává, že pasterizace po dobu 30 minut při 65 °C nijak neovlivňuje koncentraci jednotlivých isoflavonů. Další studie (Uzzan & Labuza, 2004 a Uzzan et al., 2007), také poukázaly na to, že tepelná úprava nemá žádný vliv, respektive vystavování teplotám 82°C po 120 sekund, 120°C po 24 sekund a 140°C po dobu 2 a 20 sekund. [29]

Tabulka III - Účinky pasterizace na koncentraci isoflavonů

		C		S
		Před pasterizací	Po pasterizaci	Před pasterizací	Po pasterizaci
Koncetrace v nevysušené fázi
Daidzein	μg/L	52,9	50,8	48,2	47,3
Genistein	μg/L	170,4	169,4	154,9	156,1
Glycitein	μg/L	15,7	15,4	18,4	16,4
Equol	μg/L	4,4	4,0	27,9	26,7
Celková	μg/L	243,4	239,6	249,3	246,5
Koncetrace v sušině
Daidzein	μg/L	369,0	385,2	366,0	363,2
Genistein	μg/L	1275,9	1285,3	1176,0	1194,7
Glycitein	μg/L	117,3	117,0	139,4	125,7
Equol	μg/L	32,7	30,3	211,8	204,7
Celková	μg/L	1821,9	1817,9	1893,1	1887,3

C - kontrolní skupina zvířat krmena směsí z řepky

S - pokusná skupina zvířat byla krmena směsí z plnotučné extrudované sóji