Masarykova univerzita přírodovědecká fakulta

2.4Výsledky a diskuze

2.4.1Chromatogramy

Celkově byly sledovány koncentrace čtyř isoflavonů daidzeinu, genisteinu, glyciteinu a equolu. Před vlastím měřením vzorků bylo na kolonu nastříknuto 5 µl směsi standardů isoflavonoidů a vnitřního standardu 4-HBP. Získaný chromatogram je na obrázku 10.


Obrázek 11 - EIC chromatogram směsi standardů


Obrázek 10 - TIC chromatogram směsi standardů
Z chromatogramu byly extrahovány píky pro hmoty odpovídající sledovaným analytům: 1-daidzein, 2-glycitein, 3-equol, 4-genistein, 5- 4-HBP´(obrázek 11).
Dále bylo provedeno stanovení daidzeinu, glyciteinu, equolu a genisteinu za pomocí vnitřního standardu 4-HBP v jednotlivých vzorcích jogurtů. Na následujícím obrázku 12 je ukázka celkového chromatogramu a chromatogramu s extrahovanými hmotami, kde lze vidět pík daidzeinu s rerenčním časem 10,76 min, glycitein 11,29 min, equol 11,60 min, genistein 12,29 min a 4-HBP 12,64 min.

Obrázek 12 – Ukázka TIC a EIC chromatogramů vzorku

2.4.2MS spektra

Obrázek 13 - Hmotností spektrum daidzeinu

Na hmotnostním spektru daidzeinu (obrázek 13) lze pozorovat pík o hodnotě 253,05 m/z odpovídající jeho molekulovému píku.


Obrázek 14 - Hmotností spektrum glycitienu

Analogicky na následujícím hmotnostním spektru je vidět molekulový pík odpovídající glyciteinu (obrázek 14) jehož hodnota je rovna 283,06 m/z.


Obrázek 15 - Hmotností spektrum equolu

Na hmotnostním spektru equolu (obrázek 15) můžeme pozorovat pík o hodnotě 241,08 m/z, který odpovídá jeho molekulovému píku.


Obrázek 16 - Hmotností spektrum genisteinu
Na hmotnostním spektru genisteinu (obrázek 16) lze pozorovat pík o hodnotě 269,05 m/z odpovídající jeho molekulovému píku.


Obrázek 17 - Hmotností spektrum 4-HBP
Nakonec u hmotnostního spektra 4-HBP (obrázek 17) můžeme pozorovat pík o hodnotě 197,06 m/z, který odpovídá jeho molekulovému píku.

2.4.3Hladiny v jogurtech

Obrázek 18 - Hladina daidzeinu v jogurtech

Daidzein

Ve všech vzorcích analyzovaných jogurtů byl nalezen daidzeinu (obrázek 1). Jeho hladiny se pohybovaly v rozmezí od 10,29 ± 0,59 ng/ml u vzorku K4 po 317,33 ± 45,08 ng/ml u vzorku K1. Ve skupině pokusných vzorků byla průměrná koncentrace 142,94 ng/ml a ve skupině kontrolní 172,26 ng/ml. Nižší hodnota průměrné koncentrace daidzeinu v pokusné skupině mohla být dána rychlejším metabolismem daidzeinu na equol u dojnic adaptovaných na příjem sójového extraktu. Pokusné vzorky P1 a P2 se hladinou daidzeinu velice liší od vzorků P3 a P4. Tato skutečnost mohla být zapříčiněna například chybou ve zpracování vzorků. Dalším důvodem může být variabilita u zvířat a také posléze ve výrobě jogurtů nebo u vzorků P1 a P2 mohlo dojít k efektivní přeměně daidzeinu na equol. Vysoké koncentrace daidzeinu u vzorků od kontrolních dojnic K1 (317,33 ± 45,08 ng/ml) a K2 (264,55 ± 7,35), by se daly vysvětlit skutečností, že krmivo pro kontrolní skupinu dojnic obsahovalo luční seno, které může obsahovat na isoflavony bohatý jetel, který je zdrojem formononetinu, ze kterého může působením ruminální mikroflory vznikat daidzein. V literatuře existuje několik informací o hladinách isoflavonů v mléce, bohužel o hladinách v jogurtech je jich méně. V publikaci Křížová a kol. [29] byly naměřeny hladiny daidzeinu v jogurtech 50,8 ng/ ml u skupiny krmených potravou na základě řepky a 49,5 ng/ml u jogurtů vyrobených z mléka od dojnic, kterým bylo podáváno krmivo obohacené o extrudovanou plnotučnou sóju. Koncentrace v mléce byly naměřeny například v publikaci Třináctý a kol. [35] 12,5 ng/ml u dojnic krmených řepkou a 15,6 ng/ml u dojnic krmených extrudovanou plnotučnou sójou. Vliv krmiva obsahující sóju na hladinu daidzeinu také měřily Krajčová a kol.[36], kde se hladina pohybovala mezi 10 – 16 ng/ml u kontrolních krav a 13 – 19 ng/ml u krav krmených plnotučnou extrudovanou sójou.

Mezi kontrolními a pokusnými hodnotami koncentrací daidzeinu nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl a proto nelze podle těchto měření dokázat, že přídavek sójového koncetrátu do krmiva má vliv na hladinu daidzeinu v jogurtech.

Genistein

Obrázek 19 - Hladina genisteinu v jogurtech

Hladiny genisteinu (obrázek 2) byly ve vzorcích naměřeny ovšem relativně nízké. Pohybovaly se od 5,73 ± 0,54 ng/ml u vzorku P2 po 18,87 ± 3,13 ng/ml u vzorku K1. Ve skupině pokusných vzorků byla průměrná koncentrace 10,56 ng/ml a ve skupině kontrolní 11,91 ng/ml. Hladiny genisteinu v jogurtech naměřené v publikaci Křižová a kol. [29] jsou mnohem vyšší a to 167,6 ng/ml u kontrolní skupiny a 145,1 ng/ml u skupiny pokusné. Nízké koncentrace genisteinu v mléce (1,72 – 2,22 ng/ml) naměřili Andersen a kol.[37], které bylo získáno krav krmených siláží z vojtěšky a kukuřice v různém poměru. Hladiny genisteinu v mléce také zkoumali Třináctý a kol.[35], kteří dospěli ke hladinám 34,4 ng/ml u kontrolního mléka a 37,3 ng/ml u mléka od dojnic krmených extrudovanou plnotučnou sójou.

Naše výsledky kontrolní a pokusné skupiny se statisticky neliší a proto ani u genisteinu nelze potvrdit vliv přídavku sójového koncentrátu na jeho úroveň v jogurtech.

Glycitein

Obrázek 20 - Hladina glyciteinu v jogurtech

Ve všech vzorcích byl kvantitativně detekován glycitein (obrázek 3) v rozmezí od 7,76 ± 2,61 ng/ml (K3) do 14,4 ± 1,78 ng/ml (K1). Ve skupině pokusných vzorků byla průměrná koncentrace 10,93 ng/ml a ve skupině kontrolní 10,65 ng/ml. Naměřené koncentrace jsou podobné výsledkům 14,8 -15,8 ng/ml z publikace Křížová a kol.[29]. Úrovní glyciteinu v mléce se zabývali Andersen a kol. [38], kteří dospěli k hodnotám 3,35 – 4,45 ng/ml lišící se v závislosti na typu krmení.

V našem případě nebyl žádný rozdíl v koncentracích kontrolní a pokusné skupiny a proto i u glyciteinu nelze najít souvislost mezí zvýšeným příjmem isoflavonů v potravě a jejich hladinou v jogurtech.

Equol

Obrázek 21 - Hladina equolu v jogurtech

Equol byl detekován ve všech vzorcích (obrázek 4). Naměřené koncentrace u kontrolní skupiny byly v rozpětí od 41,33 ± 4,74 ng/ml (K4) do 79,75 ± 0,69 ng/ml (K2). Pokusné jogurty obsahovaly equol v rozmezí od 107,69 ± 5,24 ng/ml (P4) do 173,95 ± 6,93 ng/ml (P3). V publikaci Křížová a kol. [29] byly naměřeny nižší koncentrace equolu než v našem měření a to 6,0 ng/ml u kontrolních jogurtů a 26,8 ng/ml u jogurtů vyrobených z mléka od dojnic, kterým bylo podáno krmivo obohacené o plnotučnou extrudovanou sóju. Publikace Kuhnle a kol. [43] se zabývala hladinami equolu v živočišných výrobcích, mimo jiné hladinami v jogurtu a u různých typů jogurtů naměřili hladiny pohybující se od 1 µg/100g po 5 µg/100g na výrobku. Několik publikací se zaměřovalo na koncentrace equolu v mléce. Například Hoikkala a kol. [39] se zabývali hladinou v equolu v mléce z konvenční produkce (62 ± 16 ng/ml) a v mléce pocházejícího z bio farem (411 ± 65 ng/ml). Rozdílem mezi klasickým a bio chovem se také zabývali Antignac a kol. [40], kteří naměřili hodnoty 36,4 ± 14,8 ng/ml u klasického chovu a 191,0 ± 72,0 ng/ml v mléce pocházejícího z přírodního chovu.

Vysoké koncentrace equolu 355,42 ng/ml a 214,97 ng/ml také naměřili Anderson a kol. [38] v mléce, které pocházelo od dojnic krmených jetelem lučním, který je zdrojem isoflavonů v klasickém krmivu.

Průměrná koncentrace equolu v pokusných jogurtech byla 136,57 ng/ml, což je více jak dvakrát vyšší než průměrná koncentrace 59,35 ng/ml naměřená v kontrolních jogurtech. Rozdíl koncentrací mezi kontrolní a pokusnou skupinou vzorků je značný a tudíž u equolu jako u jediného zkoumaného isoflavonoidu můžeme říci, že vyšší příjem isoflavonů v potravě dojnic zapříčinil vyšší koncentraci v jejich mléce a následně v jogurtech.