268
Buna baxmayaraq, bu xromatoqrafiya növünün eksk-
lyuziya prinsipi tam sübut olunmamış sayılır, şəbəkə effekti və
helin istifadə edilməsi isə daha geniş yayılmış adların kök
salması üçün əsas kimi xidmət göstərir.
İstifadə olunan helin növündən asılı olaraq, şəbəkəli xro-
matoqrafiya üzvi həlledicilərdə qabaran, lipofil polimerlərdə
həyata keçirilən hel – nüfuzedici və hidrofil hellərin istifadə
olunmasına əsaslanan hel – filtrləyici olmaqla iki yerə ayırılır.
Hel-filtrləyici xromatoqrafiyada daşıyıcı qismində se-
fadeks daha geniş tətbiq olunur. mikrobioloji yolla saxarozadan
alınan və qlükoza qalıqlarından ibarət olan yüksək molekullu
polisaxaridin, yəni calanmış dekstranın əmtəəlik adıdır.
Dekstrandakı hidroksil qruplarının yüksək miqdarı onu çox
hidrofil edir. Dekstranın calanması epixlorhidrinlə, qələvi
mühitində həyata keçirilir. Nəticədə, müxtəlif ölçülü dənəciklər
şəklində dekstran heli (sefadeks) alınır.
Pharmacia Fine Chemicals A. B. Upsala
(İsveç) firması
qabarma dərəcəsinə görə bir – birindən fərqlənən G-10-dan G-
200-dək 8 növ (tip) sefadeks istehsal edir. Qlobulyar əzələ
zülallarını və 4000-dən 150000 – dək molekul çəkisinə malik
olan peptidləri ayırmaq üçün G-100 tipli sefadeks daha yararlı
hesab olunur. Monosaxaridləri G-10 tipli sefadeksdə daha
yaxşı ayırmaq mümkün olur. Adətən, heli toz halında istehsal
edir, lakin əgər bufer məhlula konservant qismində 0,02%-li
natrium azid əlavə edilirsə, o, kolonkada qabarmış vəziyyətdə
saxlanılır.
Xromatoqrafiya zamanı 20-250 sm uzunluğu və 20-50
mm diametrə malik kolonka qabarmış hel ilə doldurulur, oraya
sınaq nümunəsi əlavə edilir və sabit sürətlə ayrılan maddələrin
fraksiyaları həlledicilərlə elyurə edilir. Elyuatdakı maddələrin
paylanmasının analizi müxtəlif üsullarla həyata keçirir:
spektrin ultrabənövşəyi oblastda udulmasını ölçməklə, quru
qalığa görə, rəng reaksiyalarının köməyi ilə. Kolonkadan
zülalların çıxması, adətən 280 nm, bəzi hallarda isə 230 və ya
310 nm dalğa uzunluğunda elyuatların optik sıxlığına görə
269
nəzarət edilir (tənzimlənir), yəni analizin başlanğıcından pikin
maksimum çıxımı anınadək keçən müddətlə təyin olunan
zaman xidmət göstərir.
Sınağın konkret şəraitləri üçün hər bir maddənin xarak-
teristikası kimi, tutulub saxlanma müddəti xidmət göstərir. Bu
göstərici, analizin başlanğıcından pikin maksimum çıxım anı-
nadək keçən zamanla, yəni maksimal optik sıxlıqla təyin olu-
nur. maddələrin miqdarı analizi ona əsaslanır ki, xromatoq-
ramda hər bir pikin sahəsi, qarışıq komponentin bu pikə uyğun
gələn konsentrasiyasına mütənasibdir (bax: “Xromatoqrafiya
piklərinin sahələrinin təyini”).
3.10.2. Molekulyar şəbəkələrdə
zülalların xromatoqrafiyası
Qida məhsullarının tərkibində mövcud olan zülallar,
onların müxtəlif həlledicilərdə həll olmasına görə fraksiyalan-
dırmaqla çıxarılır. Zülalların ekstraksiyasını ya xırdalanmış
məhsulun çəki nümunəsindən bilavasitə, ya da onu tədqiq
edilən obyektdə nəmliyin və yağların mövcud olan miqdarın-
dan asılı olaraq 1:10 və daha böyük nisbətlərdə 10
0
С tempe-
raturlu soyuq asetonla işləmək yolu ilə öncədən susuzlaş-
dırdıqdan və yağsızlaşdırdıqdan sonra həyata keçirilir. Bundan
sonra asetonu filtrdən keçirir, məhsulu isə vakuum altında, otaq
temperaturuna bərabər istilikdə qurudulur. Həll olmasına görə
zülal fraksiyaları molekulyar şəbəkələrdə xromatoqrafiya
edilir.
Əzələ zülallarının ekstraksiyası aşağıda şərh edilən qay-
dada həyata keçirilir. Xırdalanmış 10-15 q miqdarında balıq, ət
və ya heyvani mənşəli digər zülallı məhsula (2-4 q su-
suzlaşdırılmış və yağsızlaşdırılmış çəki nümunəsinə) 50 ml 7,5
pH və 0,05 ion gücünə malik soyudulmuş fosfat buferi əlavə
edilir. Qatışığı hər 1 dəqiqədən sonra 10 san fasilələrlə 3 dəqə
ərzində homogenləşdirir və 14-16 saat ərzində soyuducuda
saxlanılır.
270
Şəkil 26. Diri karp balığının miofibrilyar
(a) və sarkoplazmatik (b) zülallarının xromatoqramları
1 – aktomiozin + miozin; 2 – f – aktin; 3 – q – aktin +
tropomiozin; 4 – qlobulin; 5 – miogen; 6 – mioalbumin;
7 – kiçikmolekullu azotlu maddələr
Homogenləşdirilmiş kütlə sonra 0 – 4
0
C temperaturda və
6000 dövr/dəq. çevrəvi sürəti ilə 30 dəq. ərzində sentrifuqa-
lanır. Maye hissəni süzür sınaq şüşələrində qalan çöküntülər isə
271
eyni göstəricilərə malik fosfat buferi ilə yenidən iki dəfə işlən-
məyə məruz qoyulur. İşləmələrdən sonrakı bütün süzüntüləri
bir yerə toplayır, filtrlənir və bufer məhlulu ilə 250 ml-lik
kolbada ölçü xəttinədək doldururlar.
Ekstraktda sarkoplazmatik zülallar və kiçikmolekullu
azotlu maddələr mövcud olur. Hüceyrə qalıqları 7,2 pH ion gü-
cünə malik 50 ml fosfat buferində homogenləşdirməyə məruz
qoyulur və sarkoplazmatik zülallara analoji olaraq, məhlula
keçən miofibrilyar zülallar ayırılır. Hüceyrə qalıqları 50 ml
soyudulmuş 0,1 n. NaOH məhlulunda, yuxarıda şərh olunan
üsulla homogenləşdirirlər. Ekstraktda denaturasiyaetmiş
zülallar alınır. Hüceyrə qalıqları hollagen və elastin kimi
zülallara malik olur ki, bunların da miqdarını tərkibində olan
oksiprolinə görə müəyyən etmək mümkündür.
Zülalların hər fraksiyadakı miqdarını (
25
,
6
N
) qəbul-
olunmuş ümumi üsullarla, məsələn, Keldal üsulu və ya mo-
difikasiya olunmuş Konvey üsulu ilə təyin edilir. Qeyri-zülali
azotu təyin etmək üçün məhsulun çəki nümunəsi 7,2 pH və 0,5
ion gücünə malik fosfat buferi ilə işlənilir. Ekstraktdakı zülallar
5,0%-li trixlorsirkə turşusu ilə çökdürülür.
Əzələ zülallarının xromatoqrafik ayrılması G-100 markalı
sefadeksdə həyata keçirir ki, bunu da qabaqcadan fosfat buferi
ilə isladılır və qabarması üçün 72 saat ərzində saxlanılır. Ko-
lonkanı qabarmış sefadekslə doldurulur (kolonka 60x2,5 sm
ölçülü olduqda daha yaxşı nəticə əldə olunur) və 24 saat
ərzində ondan, 30-35 ml/saat sürəti ilə fosfat buferi buraxılır.
Bundan sonra ehtiyatla damcıtökən pipet vasitəsilə 5-10 mq
zülallara malik olan 4-5 ml ekstrakt götürülüb kolonkada
təbəqələşdirilir. Zülali ekstraktın hopması tam başa çatdıqdan
sonra bufer məhlul buraxılır və avtomat fraksiyalaşdırıcı kol-
lektorun köməyi ilə 8-10 saat ərzində elyurəedilən məhlul hər
biri 5 ml olmaqla sınaq şüşələrinə yığılır. Elyurəolunmuş məh-
lulların optik sıxlıqlarını spektrofotometrdə 280 nm dalğa
uzunluğunda, kolonkadan ilk sınaq şüşəsinə yığılan bufer məh-
Dostları ilə paylaş: |