Synaptic elimination and the complement system in

Synaptic elimination and the complement system in Alzheimer’s disease 

22 

3.4

 

Behavioural testing 

To investigate if the C3 KO mice displayed an abnormal learning ability, we 

assessed  their  aptitude  for  contextual  and  cued  fear  conditioning.  Two 

paradigms of fear conditioning (brief delay and trace), were tested. 

Training  was  carried  out  in  two  different  settings  (differing  in  visual 

appearance and smell), one setting was safe (no shocks delivered) and one 

setting was unsafe (shocks delivered). The shocks were paired with tones. In 

the brief delay paradigm the tone and shock were temporally close, whereas 

they were more separated in the trace paradigm. 

The basic concept is that contextual fear conditioning (using the cues that are 

present  in  the  conditioning  box  throughout  the  entire  conditioning  session) 

tests  hippocampal-dependent  learning  and  memory,  while  cued  fear 

conditioning (using the cue that is explicitly paired with the shock, the tone in 

this  case)  tests  hippocampal-independent/amygdala-dependent  learning  and 

memory.  Animals  with  hippocampal  lesions  can  still  learn  cued  fear 

conditioning,  but  are  impaired  on  contextual  fear  conditioning  (Otto  and 

Poon 2006). Cued fear conditioning becomes hippocampal-dependent when 

there is a longer delay between the end of the tone and the beginning of the 

shock.  Hence,  memory  of  the  tone-shock  association  using  the  brief  delay 

procedure reflects hippocampal-independent memory, while memory of the 

contextual cue-shock association in either procedure and memory of the tone-

shock association in the trace delay procedure reflect hippocampal-dependent 

memory. 

3.5

 

Antibody- based assays 

The  biggest  issue  with  antibody-based  assays  is  the  specificity  of  the 

antibodies used. In the present work, all antibodies used were commercially 

available  and  specificity  was  assured  by  the  manufacturers.  No  additional 

validation was performed. 

3.5.1

 

Immunohistochemistry 

In 

order 

to 

corroborate 

the 

electrophysiological 

findings, 

immunohistochemical detection of synapses was performed. Thin sections of 

hippocampal  tissue  were  made.  These  were  incubated  with  an  antibody 

specific for the presynaptic protein VGLUT1, the primary antibody. This was 

followed  by  incubation  with  a  fluorescently  labelled  antibody  against  the 

primary  antibody,  thus  providing  amplification  of  the  signal,  while 

---

Jonny Daborg 

23 

maintaining the specificity of it, and enabling visual detection of presynaptic 

terminals. Images were then taken by use of confocal microscopy. 

Because of the small size and vast amount of synaptic puncta, an automated 

high content analysis of the images was performed (Dragunow 2008) by an 

investigator blind to the genotype of the sections. 

3.5.2

 

Western blot 

Western  blot  is  a  commonly  used  method  to  detect  a  specific  protein  in  a 

sample. Relative difference in amounts of the protein can also be estimated. 

Briefly,  proteins  were  extracted  from  freshly  dissected  hippocampal  tissue, 

and total protein concentrations were measured. Subsequently, equal amounts 

of protein were added to a gel, and under the influence of an electric field the 

proteins  run  down  the  gel,  distributed  according  to  size.  Then  the  proteins 

were transferred to a membrane that was incubated with a primary antibody, 

followed  by  incubation  with  an  enzyme  linked  secondary  antibody  which 

catalyses a reaction producing a chemiluminescent signal which is quantified 

and taken as a measure of the protein. 

The  drawback  with  western  blot  is  that  it  does  not  provide  any  absolute 

concentrations, but when the question posed only regards relative differences, 

western blot is a sufficient method. 

3.5.3

 

ELISA 

ELISA is an abbreviation for enzyme-linked immunosorbent assay, and that 

is  exactly  what  it  is.  An  antibody  specific  for  the  protein  of  interest  is 

attached to a surface (e.g. well, plate, or beads), the sample containing the 

protein to be analysed is added to the surface, and as a consequence of the 

specific antibodies attached to this, the protein will be adsorbed to the surface 

(immunosorbed). This is followed by washing, thus leaving only the protein 

of interest on the surface, then an enzyme linked or biotinylated antibody is 

added. In the case of a biotin-conjugated antibody, a secondary streptavidin-

conjugated enzyme is added. Thus the protein to be analysed is sandwiched 

between  two  specific  antibodies  and  each  such  complex  is  linked  to  an 

enzyme.  In  the  final  step,  a  substrate  for  the  enzyme  is  added,  and  the 

reaction  is  quantified  using  a  set  of  standard  samples  containing  known 

concentrations of the analyte. 

An  ELISA  can  be  more  sensitive  than  a  western  blot,  and  allows  for 

measurement of absolute concentrations. This is necessary for analysis of all 

---

Synaptic elimination and the complement system in Alzheimer’s disease 

24 

chemical biomarkers where concentrations are indicative as opposed to mere 

presence. 

3.6

 

qPCR 

Real time quantitative PCR (qPCR) is a PCR-based technique for quantifying 

nucleic acids. In the present thesis it was combined with reverse transcription 

PCR, where mRNA is transcribed to its corresponding complementary DNA 

(cDNA).  The  cDNA  is  then  amplified  by  PCR.  Instead  of  quantifying  the 

PCR  product  after  the  reaction,  the  PCR  product  is  measured  during  the 

reaction  in  real  time.  Here  this  was  accomplished  by  the  presence  of  a 

molecule  that  fluoresce  when  it  binds  to  double  stranded  DNA  (SYBR 

GREEN), thus when the single-stranded DNA recombines in the PCR cycle. 

Quantification is based on comparison with a standard curve, and to correct 

for variation between different samples, the signal from the gene of interest is 

normalised to that of a stably expressed reference gene. 

3.7

 

Statistics 

Most  science  is  based  on comparisons,  e.g.  different  experimental  settings, 

study  groups  or  changes  over  time.  The  common  way  of  dealing  with  the 

analysis  is  to  evaluate  two  hypotheses  –  the  null  hypothesis,  according  to 

which  the  difference  between  the  groups  is  zero,  and  the  alternative 

hypothesis, according to which there is a difference in the material. Normal 

variation  in  combination  with  chance  can  result  in  seemingly  substantial 

differences  between  different  samples;  therefore  it  is  important  to  estimate 

the element of chance. This is usually done by calculating a p-value which is 

the probability of the observation occurring while the null hypothesis is true. 

Differences  are  denoted  as  significant if the p-value fall  under a  stipulated 

cut-off level, usually set to 0.05. Thus, if the p-value is lower than 0.05, the 

null hypothesis should be refuted, and the alternative hypothesis accepted. 

If the null hypothesis is rejected though no true difference actually exists, a 

Type I error has been made (the probability for this to occur is the stipulated 

significance level). Conversely, if the null hypothesis is accepted while a true 

difference actually exists, a Type II error has been made. To avoid Type II 

errors  it  is  necessary  to  have  a  large  enough  sample  size  in  respect  to  the 

variability  in  the  variable  investigated.  The  necessary  sample  size  can  be 

estimated  by  a  power  calculation.  Statistical  power  is  the  probability  of 

detecting a true difference, if it exists, hence of not making a Type II error. 

---