Synaptic elimination and the complement system in

Jonny Daborg 

15 

Recent animal studies have shown that synaptic elimination is dependent on 

the  complement  system.  Interestingly,  knockout  of  C1q  in  transgenic  mice 

expressing  human  APP  with  FAD  mutations  produces  a  minor 

neuropathological  phenotype  (Fonseca  et  al.  2004).  In  line  with  this 

mechanism of elimination, investigation of post mortem brain tissue from AD 

patients have shown increased levels of complement mRNA (Yasojima et al. 

1999), this finding has been further supported by studies showing increased 

levels of complement proteins in the CSF from AD patients (Finehout et al. 

2005;  Wang  et  al.  2011).  In  addition,  it  has  been  shown  that  the  genes 

encoding complement receptor 1 (CR1) and complement factor H (CFH) are 

associated with AD diagnosis (Harold et al. 2009; Lambert et al. 2009; Naj et 

al. 2011; Seshadri et al. 2010; Zetterberg et al. 2008). 

In  conclusion,  these  findings  warrant  a  closer  investigation  of  the 

involvement of the complement system and synaptic elimination in AD. 

 

---

Synaptic elimination and the complement system in Alzheimer’s disease 

16 

2

 

AIM 

2.1

 

The general aim 

The  general  aim  of  this  thesis  was  to  examine  the  hypothesis  that  AD  is 

primarily  a  synaptic  disease  –  with  an  emphasis  on  complement-mediated 

elimination of synapses. 

2.2

 

The specific aims 

I.

 

To examine if genetic variation in the gene encoding the 

RAGE receptor is associated with AD. 

 

II.

 

To investigate if the complement system is involved in 

elimination of synapses in the hippocampus of mice. 

 

III.

 

To measure the levels of C3, C4, and CR1 in CSF from 

patients with MCI, probable AD, MCI patients who later 

developed  probable  AD,  and  compare  them  with  the 

levels in healthy controls, with the purpose of evaluating 

these  proteins  as  potential  biomarkers  for  AD,  and  to 

gain evidence for complement involvement in AD. 

 

IV.

 

To  evaluate  the  complement  genes  CR1,  C3,  C2  and 

CFB as possible susceptibility genes for AD. 

 

---

Jonny Daborg 

17 

3

 

METHODOLOGICAL 

CONSIDERATIONS 

3.1

 

Subjects 

The subjects of the different studies were chosen to best provide an answer to 

the questions posed in the specific aims. In general I have preferred to work 

with  human  subjects  for  both  scientific  and  ethical  reasons  -  mice  do  not 

become demented nor can they provide consent. 

3.1.1

 

Patients 

For  details  on  diagnostic  procedures  and  other  information  on  the  patients 

please  refer  to  the  different  papers.  The  patients  in  our  studies  were 

diagnosed  with  MCI,  AD  or  other  neurodegenerative  conditions  using 

standardised  clinical  methods  and  test  batteries  performed  by  psychiatrists 

and  psychologists at specialised  memory  clinics.  Controls  were  cognitively 

normal according to these tests. A clinical diagnosis of AD is not perfect and 

it  has  been  estimated  that  10-16%  misdiagnoses  occur  in  relation  to 

neuropathology  (Brunnstrom  and  Englund  2009;  Galasko  et  al.  1994; 

Victoroff et al. 1995), which often is considered the gold standard diagnostic 

method. Biomarkers for AD neuropathology, e.g., CSF levels of Aβ42 and 

tau  proteins,  may  help  to  increase  the  diagnostic  accuracy  compared  with 

clinical criteria (Blennow et al. 2010), but studies showing this for a fact are 

still lacking. Clinical AD diagnoses in papers I and IV were confirmed either 

by a typical CSF tau and Aβ biomarker profile or at autopsy according to the 

neuropathological CERAD criteria for definitive AD (Mirra et al. 1991). 

3.1.2

 

Mice 

To study the role of the complement system in elimination of synapses in the 

hippocampus, mice deficient in C3 were used (Pekna et al. 1998). These mice 

do not lack the whole gene, but the critical exon 24, which renders the gene 

product incomplete and thus non-functioning (Pekna et al. 1998). To ensure 

almost identical genetic backgrounds between WT controls (C57Bl/6) and C3 

knockout  mice  (C3  KO),  the  C3  KO  mice  were  backcrossed  for  13 

generations. 

---

Synaptic elimination and the complement system in Alzheimer’s disease 

18 

3.2

 

Genotyping 

Genotyping of single nucleotide polymorphisms (SNPs) was made by use of 

TaqMan  allelic  discrimination,  a  polymerase  chain  reaction  (PCR)-based 

assay.  PCR  is  a  method  of  DNA  amplification,  based  on  the  molecular 

mechanisms  of  DNA  replication  (Mullis  and  Faloona  1987).  A  sample  of 

DNA is heated to approximately 95ºC to make the two DNA strands separate, 

subsequently  the  temperature  is  lowered  to  50-60ºC  in  order  to  enable 

hybridisation of two oligonucleotides (predesigned DNA molecules that bind 

to  a  specific  region  of  the  genome)  that  flank  the  desired  sequence  of  the 

sample  DNA  and  work  as  primers  for  the  DNA  polymerase.  Then  the 

temperature is raised  again,  to  72ºC,  and  the  heat-stable  DNA  polymerase, 

Taq  polymerase,  will  commence  with  the  work  of  replicating  the  DNA 

sequence singled out by the primers. Thus, the sequence of interest is doubled 

for each cycle. 

The  TaqMan  allelic  discrimination  is  accomplished  by  cleavage  of  a 

fluorescent  dye  from  the TaqMan  probe  by  the exonuclease  activity  of the 

Taq polymerase as it replicates the SNP-containing sequence. Two probes are 

used  in  the  reaction,  one  for  each  allele,  thus  enabling  identification  of 

heterozygotes and both kinds of homozygotes (Livak et al. 1995). 

PCR  is  easy  in  theory  but  difficult  to  optimize  in  practice.  In  the  present 

thesis all genotyping experiments were performed by certified lab technicians 

specialised in molecular genetics, using commercially available kits. 

TaqMan  allelic  discrimination  is  an  excellent  method  for  genotyping  a 

limited  number  SNP   since  no  post-PCR  handling  is  required,  thus,  

minimizing the risk of contamination. 

3.3

 

Electrophysiology 

Electrophysiology  was  chosen  as  the  primary  method  for  quantifying 

synapses  for  the  reason  that  the  assessment  only  concerns  functional 

synapses. 

3.3.1

 

Hippocampal slice preparation 

The hippocampus (fig. 1 in paper II) has been extensively studied in the past 

40 years. It is a brain formation of fundamental importance for learning and 

memory, it is easily recognised, and the cell layers are arranged in a laminar 

way  which  makes  the  structure  very  suitable  to  use  when  recording 

---