Işik mikroskopik teknikler
Elastik Fibriller ve Mast Hücreleri İçin Luna Boyama Yöntemi
Yüklə 0,49 Mb.
|
Elastik Fibriller ve Mast Hücreleri İçin Luna Boyama YöntemiBu yöntem, formalinle tespit edilip parafine gömülmüş dokularda elastik fibriller ve mast hücrelerinin gösterimi için kullanılır. Frozen kesitler için de kullanılabilir. Fiksasyon: % 10 formalin Kesit: 5 µm’lik parafin kesitler Çözeltiler ve Reaktifler: Aldehit Fuksin Çözeltisi:
2-3 gün bekletip kullanmadan hemen önce filtre ediniz. 4 C de birkaç hafta saklanabilir.
Stok çözeltisi A: 100 ml 95 % alkol içindeki 1 g hematoksilen çözülür. Stok çözeltisi B: 95 ml distile su içine 4 ml 29% ferric chloride çözülür ardından 1 ml konsantre hidroklorik asit eklenir. Çalışma çözeltisi: A ve B den eşit miktarlar da karışırılır. 3 ay tekrar kullanılabilir.
Methyl orange (Sigma) --------------0.25 g Alkol (95%) ---------------------------- 100 ml İyice karıştırın ve kullanmadan önce süzün.
Sonuçlar: Elastik fibriller-------------------------- mor Mast hücreleri-------------------------- mor Nukleuslar------------------------------- siyah Zemin-------------------------------------sarı
Floresans teknikler çok kullanılır. Floresans mikroskopi, dokulardaki ve serumlardaki antijen ve antikorların gösteriminde kullanılan immüno-floresans tekniklerin temelini oluşturur. TESPİT EDİLMİŞ DOKULARI BOYAMADAKİ GENEL FAKTÖRLER 1-Fiksasyonun Boyama Üzerine Etkisi: Fiksasyon, dokularla boyaların etkileşimine yardım eder. Formaldehit ve civa klorür bazik boyaların; trikloroasetik asit, pikrik asit ve krom bileşikleri asit boyaların hareketini kolaylaştırır. Etil alkol veya asedik asitle fiksasyondan sonra asidik ve bazik boyalar dokular tarafından kolaylıkla alınır. Bazen tespit edici ajan doku-boya arasında mordant olarak hareket edebilir. Bu duruma, hematoksilenle miyelin gösteriminde dokunun potasyum bikromatla tespiti örnek verilebilir. 2-Progressif ve Regressif Boyama: Progressif boyama tekniğinde, doku bileşenleri sıra ile renklenir ve boya çözeltisinde uygun süre sonunda dokular tatmin edici biçimde differensiyel olarak renklenir. Regressif teknikte ise dokular önce fazla boyanır, ayrıntılar izlenemez. Sonra dokunun istenmiyen kısımlarından fazla boyanın alınır veya differensiye edilir. Regressif teknik daha çok kullanılır. 3-Direkt ve İndirekt Boyama: Anilin boyaların sulu veya alkolik çözeltileri dokuları mükemmel olarak renklendirir ve direkt boyama olarak bilinir. Hematoksilen gibi boyalarda ise dokunun boya ile birleşebilmesi için mordant adı verilen ara bir maddeye gerek duyulur ve indirekt boyama olarak bilinir. Mordant olarak genellikle alumlar kullanılır. Demir, aliminyum ve krom bileşikleri boyalarla bazik boyalar oluşturmak için birleşen mordantlardır. Mordantlardan farklı olarak kullanıldıkları boyanın boyama gücünü ve seçiciliğini artıran ve boya-doku birleşmesi için gerekli olmayan bileşiklere vurgulayıcı (accentuator) adı verilir. Vurgulayıcılar anyonik boyaya eklendiklerinde asit; katyonik boyaya eklendiklerinde ise alkalidir. Anyonik boyaya asit eklendiğinde, dokuların bazik gruplarının iyonizasyonun artışı ile boyama yoğunlaşır. Fenol, karbol thionin ve karbol fuksin vurgulayıcı olarak sıklıkla kullanılırlar. 
Şekil 6: Direkt ve İndirekt Boyama: a-Direkt boyama b-Mordant ile indirekt boyama, c-Vurgulayıcı ile indirekt boyama. D:doku, B:boya , M: mordant, A: accentuator Metal çöktürme yöntemlerinde kullanılan hızlandırıcılar (accelerator) da vurgulayıcılarla aynı şekilde hareket ederler (Cajal yöntemindeki kloral hidrat ve veronal). Tuzağa düşürücü ajanlar (trapping) (tannik asit, iyodin), boyaları dokularla ve bakterilerle bir arada tutar. Metilen mavisi-eozinle boyanan kan yayması, tannik asitle muamele edilirse kromatindeki metilen mavisini tutar. Boyama sonrası alkolle dehidrasyonda boya kaybı olmaz. 4-Differansiyasyon: Regressif teknikle aşırı boyanmış dokunun differansiyasyonu veya boyanın geri alımı (de-staining), basit çözeltilerle yıkama, asitler ve oksitleyici ajanların kullanımı ile sağlanabilir. Mordantlar ve bazı boyalar, differansiyasyon ajanı olarak da hareket edebilir. Suda veya alkolde yıkama, differansiyasyonun temelidir ancak başka çözücüler de kullanılabilir. Dokularla sıkı kimyasal bağlarla birleşen boyalar bu yolla kolaylıkla differensiye olamaz fakat asit kullanımı ile parçalanabilir. Boyalar, kullanılan boyalardan doku bileşenleri için daha çok affiniteleri olduğunda differensiyasyon ajanı gibi hareket eder. Orange G gibi kuvvetli bir boya, diğer daha az hırslı boyayı yerinden çıkarır. Boya Çözeltilerinin Olgunlaşması: Bazı boya çözeltileri, günlerce, haftalarca, aylarca havaya, ışığa, ısıya maruz kaldıktan sonra boyama özelliği kazanır. Hematoksilen hazırlandıktan birkaç hafta sonra hemateine okside olarak boyama özelliği kazanır. Sodyum iyodat, civa oksit, potasyum permanganat gibi kimyasal oksitleyici ajanların kullanımıyla hemen oksidasyon sağlanır ve boya hemen kullanılarak tüketilmelidir. Süper oksidasyonla boyama etkisi ortadan kalkar. BOYALARIN SINIFLANDIRILMASI Boyalar ve boyaların uygulama şekline bakılarak direkt veya mordant boya; kimyasal yapısına bakılarak asidik, bazik ve nötr boyalar olarak sınıflandırılır. Bazı boyalar light green (açık yeşil) gibi rengi açıklayan isimlerle, bazıları kimyasal yapıyı da açıklayan isimlere (anilin mavisi) sahiptir. Bazı boyalarda ise rakamlar ve harfler bulunur. Bir boyanın adından sonraki R harfi, o boyadan daha kırmızı; 2R daha da kırmızı olduğunu gösterir. B ise genellikle mavimsi bir rengi, G (gelb) ve Y ise sarımsı rengi belirtir. Boyalar için adlandırma bir boya için bir çok sinonimin bulunmasından dolayı önemlidir. Lipid boyası olan Sudan IV, aynı zamanda Scarlet red, Scharlach rot, Oil red IV, fat ponceau R, LB veya cerotine ponceau 3B olarak da adlandırılır. Orange G’ ninde bir çok sinonimi vardır. Phloxine G ve Phloxine B gibi benzer isimli diğer boyalar birbirine benzemez. Boya indeksi (Colour Index) kullanarak karışıklık önlenebilir.
42685 Asit fuksin Acid magenta-acid violet 42005 Acridin orange Basic orange 42510 Basic fuchsin Basic magenta-basic violet Boyamada; dokular ve boyalar iyonize olarak reaksiyona girerler. Bir boyanın yoğunluğu ve hızı veya tutunması doku bileşenleri için iyonize köklerinin arzusuna bağlıdır. Karboksil gruplar zayıf asidik, fosfat ve sülfat grupları ise daha kuvvetli asidiktir. Asit fuksin ve orange G gibi sülfonlanmış boyalar, proteinlerin bazik gruplarına kuvvetli affinitesi vardır. Kuvvetli differansiyasyon isteyen güçlü bağlar oluşturarak proteinlerle bağlanırlar. Mordantlaşmış boyalar, direkt bazik boyalar gibi aynı yolla dokuyla birleşir fakat metalik mordant, sabit bir doku-metal-boya bağlanması şekillendirir. BOYA ile BOYANMANIN HAREKET ŞEKLİ Kimyasal reaksiyonlar ve fiziksel olaylar dokuların boyanmasını sağlarlar. A-Boyamadaki Kimyasal Reaksiyonlar: Bir boya renkli birleşikler oluşturmak üzere çözeltilerde anyon ve katyonlarına ayrılarak iyonize olurlar. Tipik bir bazik boya histolojide kullanılan pH oranlarında pozitif yüklüdür (katyonik); asidik boya ise negatif yüklüdür (anyonik). Amfoterik bir boya ise belli bir pH’ da yüksüz noktaya (izoelektrik nokta) sahiptir ve bu pH’nın altında bazik, üstünde ise asidiktir. Tablo 1:Bazik, asidik ve amfoterik boyaların iyonizasyonu
Tablo 2:Doku bileşenlerinin iyonizasyonu
B-Boyamadaki Fiziksel Olaylar: Boyalar dokularla absorbsiyon ile birleşebilir. Böyle boyalar suda ve alkolde differansiye olurlar. Boyamada en önemli fiziksel faktörler dokuların dansitesi ve permiabilitesidir. Her birim hacim başına fazla miktarda protein zincirine sahip dens dokular fazla boya alırlar, daha zor differensiye olurlar. Geçirgen dokularda hızla boyanıp hızla differensiye olurlar. Dokulardaki maddelerin yaşa bağlı olarak permiabiliteleri değişebilir. Farklı yaşlardaki fibrin için farklı boyama yöntemleri vardır. Fibrin yaşlanırken fibrinin yapısı daha gevşek hale gelir. Böylece büyük moleküllü boyaları daha iyi tutar. Bu prensip, amyloid boyamasına da uygulanmıştır. Boyama bazen çözünebilirlik nedeni iledir. En iyi örnek yağ boyalarından Sudan boyalarıdır. BOYAMA YÖNTEMLERİNİN BİLİMSEL KONTROLÜ Boyama yöntemleri kimyasal ve fiziksel faktörlerle sağlanır. Boyamada zaman zaman başarısızlık görülebilir. Nedenler şöyle sıralanabilir. 1-Dokuların reaktif olmaması 2-Uygun olmayan fiksasyon 3-Boyaların yapısındaki ve çözünürlüğündeki farklılıklar 4-Boya çözeltisinin yetersiz olgunlaşması veya bozulması 5-Boyanın ve çeşme suyunun pH’sındaki ve ısısındaki değişiklikler olabilir.
Histolojide en çok kullanılan boyadır. Hematoksilen, bazik bir boya olarak kabul edilirse de kendisi boya değildir. Boya olabilmesi için zincirlerinden birinde bulunan quioidin hemateine okside olması gerekir. Sulu bir çözelti içinde bir aydan fazla bir zamana gerekir. Oksidasyon, sodyum iyodat veya civa oksit eklenerek hızlandırılabilir. Fakat hemateinin ileri oksidasyonu ile boyama özelliği kaybolur. Hematein, zayıf, anyonik kırmızımtrak-sarımsı bir boyadır. İzoelektrik noktası 6.5’ tur. Zayıf bir boyadır. Fakat mordant ile kullanılırsa koyu ve devamlı bir boya olur. Genellikle aliminyum ve demir tuzları (şapları) kullanılır. En çok kullanılan şaplar:
Çekirdek mavi-siyah-koyu mavi Sitoplazma pembe Eritrositler-kas kırmızı Fibröz doku açık pembe Kıkırdak açıktan koyu maviye kadar renk tonlarında Mükoz salgı mavimtrak (metakromatik) Kalsifiye doku koyu mavi Protein çökelekleri pembe Bakteri toplulukları koyu mavi Çekirdeklerin mavi-siyah boyanmasının nedeni polianyonik DNA ‘dır ve bazik hematein-mordantla kuvvetli şekilde etkileşir. Kıkırdakların da mavi-siyah boyanmasının nedeni polianyonik glikozaminoglikanlardır. Sitoplazma pembe olarak ifade edilirse de mikroskopta mavimsi pembe olarak izlenir nedeni sitoplazmik RNA’ nın, hematein mordantla birleşmesidir. 1-HARRİS HEMATOKSİLENİ Harris’s alum hematoksilen 5 g Absolu alkol 50 cc Aliminyum amonyum sülfat 100 g Distile su 1000 cc Civa oksit 2.5 g Hematoksilen alkol içinde hafif ısıda eritilir. Aliminyum amonyum sülfatı da ısı yardımıyla distile su içinde eritilir. İkisi geniş bi r erlenmayerde karıştırılır. Hızla kaynatılır. Ateşten alınır. Kabarcıklar çıkarken civa oksit azar azar ilave edilir. Çözelti koyu mor renk alınca cam kap dıştan soğuk suya tutularak soğutulur. Boyamaya hazırdır. Fakat 2-3 gün kalsa daha olgunlaşır. Olgunlaşmış çözelti koyu renkli şişelere alınıp, ağzı sıkıca kapatılarak karanlık yerde saklanır. Boya kullanılacağı zaman % 4 oranında glasiyal asetik asit eklenir. 2-ERLİCH ASİT HEMATOKSİLENİ Hematoksilen 6.4 g Ammonium aliminyum sülfat 40 g Etil alkol 322 cc Gliserol 322 cc Distile su 322 cc 25 0C’ de 6-8 hafta beklenir. Hemen olgunlaştırmak için 0.64 g sodyum iyodat eklenir. 3-ERLİCH HEMATOKSİLENİ Hematoksilen 4 g % 95’lik etil alkol 200 cc Distile su 200 cc Gliserin 200 cc Amonyum veya potasyum alimunyum sülfat 6 g Glasiyal asetik asit 20 cc
Hematoksilen 80 g % 95’lik etil alkol 2400 cc Potasyum alum (Aliminyum potasyum sülfat) 240 g Distile su 1200 cc Gliserol 1200 cc Glasiyal asetik asit 120 cc
Hematoksilen 0.5 g Absolü alkol 10 cc Distile su 90 cc 4 hafta olgunlaşmaya bırakılır. Uygulama 1-Kesitler suya indirilir 2-Demir alumda 30 dakika-24 saat bırakılır 3-Akarsuda yıkama 4-Heidenhein hematoksilende 30 dakika-24 saat boyama 5-Suda çalkalama 6-Demir alumda 1-30 dakika mikroskopta kontrol edilerek differensiye edilir. 7-En az 10 dakika akarsuda yıkama 8-Karşıt boyalar Van Gieson ve modifiye şekilleridir.
Hematoksilen 0.5 g Gliserol 100 cc Alimunyum potasyum sülfat 25 g Distile su 400 cc Potasyum iyodat 0.1 g Hematoksileni gliserol ile karıştırın. Isı kullanmadan distile suda potasyum aumu çözün. Çözünme uzun zaman alabilir. Hematoksilene alumu karıştırarak yavaş yavaş ekleyin. 10 cc suda potasyum iyodatı karıştırarak çözün. 4-6 ay boyunca çözelti boyanma özelliğini korur. 8-% 1’lik ALKOLİK EOZİN Eozin Yelowish 10 g Distile su 50 cc % 95’ lik etil alkol 940 cc Eozini distile suda eritin. Alkol eklenir. Bu eozin stok olarak saklanır ve eşit miktarda % 95’lik alkol eklenerek kullanılır. 9-% 0.5’lik SUDAKİ EOZİN Eozin Yelowish 5 g Distile su 1000 cc
Eozin Yelowish 1 g Distile su 100 cc Thymol 1 küçük kristal HEMATOKSİLEN & EOZİN BOYAMA TEKNİĞİ 1-Ksilol 30 dakika 2- Ksilol 30 dakika 3-Absolü alkol Çalkalama 4-% 95’lik etil alkol Çalkalama 5-% 80’ lik etil alkol Çalkalama 6-% 70’ lik etil alkol Çalkalama 7-% 50’ lik etil alkol Çalkalama 8-% 30’luk etil alkol Çalkalama 9- Distile su Çalkalama 10-Hematoksilen 5-6 dakika boyama 11-Akarsu Çalkalama 12-Asit-alkol çözeltisi Daldırıp-çıkarma 13- Akarsu Çalkalama 14-Amonyak 30 saniye 15- Akarsu Çalkalama 16-Eozin 3-5 dakika boyama 17- Akarsu Çalkalama 18-% 30’luk etil alkol Çalkalama 19-% 50’ lik etil alkol Çalkalama 20-% 70’ lik etil alkol Çalkalama 21-% 80’ lik etil alkol Çalkalama 22-% 95’lik etil alkol Çalkalama 23-Absolü alkol Çalkalama 24-Absolü alkol Çalkalama 25-Ksilol 30 dakika 26-Ksilol 30 dakika (Bir gece bekletilirse daha iyi şeffaflanır).
% 80’ lik etil alkol 500 cc Hidroklorik asit 5 cc
Distile su 500 cc Amonyak 5 cc
Yüklə 0,49 Mb. Dostları ilə paylaş:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||