Işik mikroskopik teknikler

DEKALSİFİKASYON: Birçok dekalsifikasyon sıvısı vardır. Tatmin edici bir dekalsifikasyon sıvısı :

• 
  Kalsiyum tuzlarını tamamen uzaklaştırmalı
  
• 
  Hücrelerin ve bağ dokusunda az büzülme oluşturmalı
  
• 
  Boyama reaksiyonlarına zararlı etkilerinin az olması
  
• 
  Bu kriterlere ilave olarak, dekalsifikasyon hızı da histopatolojide önem taşır.
  

Dokuların dekalsifikasyonu sırasında ajitasyonun, kalsiyum tuzlarının uzaklaştırılması hızında herhangibir önemli fark olup olmadığına dair şüpheler vardır. Bazı araştırıcılar periyodik çalkalamaların veya mekaniksel ajitasyonun dekalsifikasyonunu hızlandırdığını ileri sürmüşlerdir. Dekalsifikasyonu hızlandırmak için ısının kullanımında dikkatli olunmalıdır. 37⁰ C nin üstü ısılar sadece acil durumda kullanılmalıdır. Dekalsifikasyon sıvısını, dekalsifikasyon boyunca 25 C’lik benmaride tutulmasını da önerilmektedir.

Dekalsifikasyon sıvısı, dokudan en azından 50-100 kat fazla hacimde olmalıdır. Bloklar dekalsifikasyon sıvısından süreç tamamlanır tamamlanmaz çıkartılmalıdır. Aksi taktirde kesim ve boyama aşaması zorlaşacaktır. X–ray incelenmesi ile dekalsifikasyon tamamlanıp tamamlanmadığı kesin olarak karar verilebilir.

ASİT DEKALSİFİKASYON SIVILARI: Ençok kullanılan yöntem, kalsiyum tuzlarını asit çözeltisinde çözmektir. Birçok yöntem olmasına karşın en çok nitrik asit, formik asit ve trikloroasetik asit karışımları kullanılmaktadır.

1-Nitrik Asit: Çok hızlı dekalsifiye eder fakat dokuda harabiyete yol açar ve uygulama uzun olduğunda çekirdek boyamasını inhibe eder. Bu nedenle küçük parçaların hızlı dekalsifikasyonunda kullanılırlar.

Tespit edilmiş küçük kemik parçaları distile su ile taze hazırlanmış %5-10 ‘luk nitrik aside konurlar. 4 saat sonra ve kısa aralıklarla dekalsifikasyon kontrol edilir. Dekalsifikasyon 48 saati aşmamalıdır. Bazen formalin, maserasyona ve şişmeye karşı dokuyu korumak amacı ile nitrik aside eklenir. Dekalsifikasyondan sonra dokular direkt olarak %70’lik alkole aktarılırlar. Su ile yıkamaya gerek yoktur çünkü fazla asit dehidratasyon sırasında uzaklaşacaktır. Daha az etkili fakat rutin amaçlar için yararlı bir dekalsifikasyon sıvısı Perenyi’nin nitrik asit, kromik asit ve alkol karışımıdır.

Perenyi sıvısının hazırlanışı:

• 
  %10’luk nitrik asit .................................40 cc
  
• 
  Absolü alkol .................................30 cc
  
• 
  %0,5’lik kromik asit................................30 cc
  

Çözeltisi taze olarak kullanılmalıdır ve dekalsifikasyondan sonra direkt olarak %70’lik alkole aktarılmalıdır.

2-Formik asit: Nitrik asitten daha yavaş etki yapar, dokuya daha az zarar verir ve boyamayı fazla etkilemez. Rutin kullanım için distile su ile hazırlanmış %10’luk formik asit tavsiye edilir. Daha yüksek kontrasyonlar (%30’luğa kadar) daha hızlı dekalsifikasyonu sağlarken, boyamada bozulma olabilir. Dekalsifikasyon sıvısı çok bol olmalı ve 48 saatte bir yenilenmelidir. Küçük süngerimsi kemik parçaları 2 günde, daha büyük, dens kompakt kemikler ise 20 günde dekalsifiye olurlar. Dekalsifikasyondan sonra parçalar direkt olarak %70’lik alkole aktarılırlar.

Evans ve Krajian’ın formik asitli çözeltisi daha hızlıdır ve iyi bir boyanabilirlik sağlamaktadır. Kısmen modofiye edilmiş formülü aşağıdaki gibidir. Dokular dekalsifikasyondan hemen sonra %70’lik alkole aktarılır.

• 
  Formik asit..................... 35 cc
  
• 
  %20 ‘lik sodyum sitrat.....65 cc
  

4-Trikloroasetik asit: Özellikle dişlerin dekalsifikasyonu için önerilmektedir. Trikloroasetik asitin %5’lik sulu çözeltisi taze olarak hazırlanır. Aynı konsantrasyondaki formik asitten kısmen daha hızlı hareket eder. Boyama sonuçları iyidir. Parçalar dekalsifikasyondan sonra direkt olarak %70’lik alkole aktarılır.
5- Kemik Preparatlar İçin Dekalsifikasyon Çözeltisi

Formik asit 100 cc

HCl 80 cc

Distile su 1000 cc

ELEKTROLİTİK DEKALSİFİKASYON: Hidroklorik asit ve formik asitli çözeltinın kullanıldığı bir banyo, kemiğin dekalsifikasyonu için elektrolitik bir ortam olarak kullanılır. Araştırmacılar sitolojik ayrıntıya ve boyamaya zarar vermeksizin daha hızlı bir dekalsifikasyon olduğunu iddia etmişlerdir. Birçok araştırıcı tarafından yöntemle ortaya çıkan ısının artan dekalsifikasyon hızından büyük ölçüde sorumlu olduğu fakat spesimenin kavrulma riskinin bulunduğu gösterilmiştir.

KELATLAMA AJANLARI: EDTA (etilendiamin–tetra- asetik asit), beyaz renkli suda %20 oranında çözülen kristal bir kelatlama ajanıdır. Bir dekalsifikasyon sıvısı olarak, kalsiyum iyonları ile çözünebilir non–iyonize bileşikler oluşturmak üzere birleşir. Demir tortuları ve diğer metaller de EDTA ile uzaklaştırılabilir. Çözelti nötral pH’da etkili olduğundan boyama genellikle mükemmeldir. Herhangibir dekalsifiye ajanından daha iyi sonuçlar vermektedir. Doku, EDTA ile dekalsifikasyondan sonra sertleşmez aksine kemik daha kolaylıkla kesilebilir. EDTA, diş dokuları, reaktif kemik ve kalsifiye dokular için başarı ile kullanılabilir. Kullanılan EDTA’nın dokudan 150 hacim daha fazla olması gereklidir. Rutinde aşağıda formülü verilen çözelti uygundur ve dekalsifikasyon sırasında her 5-7 günde bir yenilenmelidir. Daha zayıf bir çözelti ise daha sık değiştirilmelidir.

Nötral ETDA Dekalsifikasyon Çözeltisi

ETDA (di-sodyum tuzu) ............................250 gr

Distile su ..............................................1750 cc

Çözeltinin pH’sı yaklaşık 26 gr sodyum hidroksit eklenerek 7’ye ayarlanır. Dekalsifikasyon, örneğin yapısına bağlı olarak 4-40 günlük zaman alır. Uzun süre EDTA' ya maruz bırakma dokuların boyanmasına za­rar verir. Test için X-ray önerilir. Frozen kesitler hariç kesitler direkt olarak % 70' lik alkole aktarılırlar. Frozen tekniğinde ise kesitler mikrotom bıçağının haraplanmaması için suyla yıkanmalıdır, Dekalsifikasyon süresi ikincil olarak düşünüldüğünde, dokunun ko­runma kalitesi ve boyamaya bakıldığında EDTA' nın günümüzde mevcut olan en iyi dekalsifikasyon ajanı olduğuna dair hiçbir şüphe yoktur.

DEKALSİFİKASYONU TEST ETMEK: Dekalsifikasyon testi X-ray ile yapılmaktadır. Ancak histoloji laboratuvarlarında olmadığından genellikle X-ray denemesi yapılamaz. Bunun yerine dekalsifiye edilmiş sıvı içinde kalsi­yum tuzunu arama kimyasal testi yapılabilir. Negatif bir sonuç dekalsifikasyonun iyi gerçekleştiğini gösterir.

5 cc dekalsifikasyon sıvısına turnosol alkali oluncaya kadar damla damla güçlü amonyum eklenir. 0_.5 cc doygun amonyum oksalat eklenir. Amonyum eklemesinden sonra eğer çözelti bulanırsa, bu kalsiyum varlığını gös­terir ve çözelti test için uygun değildir. Spesimen taze, kalsiyumsuz sıvı içersine konur. Spesimenin konmasından sonra, hem amonyum hem de amonyum oksalat yeniden eklenir. Eğer 30 dakika sonra sıvı hala berraksa dekalsifikasyon başarılmış demektir. Kemik yüzeyinde kuvvetli asidik dekalsifikasyon sıvılarının gaz baloncukları oluşabilir. Eğer işlem sallanarak yapılırsa, genellikle balonlar hareket eder ve böylece dekal­sifikasyon daha sağlıklı olur.

DEKALSİFİKASYON SONRASI İŞLEMLER: Selüloz nitrat dehidratasyonu veya parafin işleminin 1. basamağındaki % 70' lik alkole dokular direkt olarak alınır. Eğer, frozen kesit preperatları yapılacaksa suda yıkanır ve depolayarak bekletmek için % 10 luk formal-salin kullanılabilir.

Frozen kesitler, kemik ve kemik tümörleri için kullanışlıdır, Dekalsifiye kompakt kemiğin küçük parçaları dondurma mikrotomunda kesilir ve herhangibir destek ortamına gerek yoktur. Ancak süngerimsi kemik trabeküllerinin ve kemik iliği hücrelerinin işlem sırasında kaybolmaması için gömülebilir. Frozen kesit yöntemi ile daha çabuk preperasyon yapılabilir.

Parafin bloklara gömme, sakıncalarına rağmen kemik patolojisinde rutin metoddur. Çift gömme, parafin ve selüloz nitrat kombinasyonu daha avantajlı bir gömme ortamıdır. Özellikle süngerimsi kemik gibi hem sert hem de yumuşak doku içeren yapılarda, plastik materyellerde bu çift materyele gömme gibi avantaj sağlarlar. Gömme ortamı seçildiğinde, dehidratasyondan sonra impregresyon iş­lemine geçilir. Gömme materyeli ile kemikler gömülür. Otomatik doku takip makinası ile 16-24 saatlik kısa işlem spongioz kemi­ğin küçük parçaları ve kemik iliği için uygun değildir. Parafin impregrasyonu için vakum fırınının kullanılması önerilmektedir. Selüloz nitrat (celloidin veya LVN), kemikte 2 önemli amaç için kullanılan değerli bir gömme ortamıdır.

1-Vertebralar gibi değişik yo­ğunluktaki geniş doku kitleleri ve femurun orta sütunu gibi dens, kortikal kemik preperasyonlarındaki kolaylığı,

2-Orta kulaktaki daha hassas kemiksi yapılarda oluşan büzülme, biçim bozulmalarını önemli ölçüde azaltır. Bu avantajlarına karşın sürecin yavaşlığı ve kesit kalınlığı­nın 15-20 mikron olması dezavantajlarıdır.

Kemik preperatları çok keskin bıçaklı ağır mikrotomla kesilir. Ke­sit kalınlığı 6-8 mikron olmalıdır. Alınan kesitlerin yapıştırıcılı bir lama alınması ve dikkatli olarak kurutulması gereklidir.

YÜZEY DEKALSİFİKASYONU: Bazen, sıklıkla da blokların trimlenmesi esnasında kesitler arasın­da beklenmeyen kalsifikasyon alanlarına rastlanır. Bu alanlar bıçağa di­rençlidir. Böyle alanlar bir bıçak ya da iğne yardımı ile kazınarak çı­karılır ya da bloklar mikrotomdan alınarak ya % 10' luk distile su ile hazırlanmış formik asit veya % 5' lik nitrik asitte 1 saat ya da daha fazla bırakılır. Progressif bir dekalsifikasyon daha sonraki boyama ba­samağını ya az etkileyerek ya da hiç etkilemeden oluşacaktır. Blok, suda biraz yıkandıktan sonra kurutulur ve mikrotoma yerleştirilir.
DEKALSİFİYE EDİLMEMİŞ KESİTLERİN HAZIRLANIŞI: Dekalsifiye edilmemiş kemik kesitlerine 2 temel amaç için gereksinim vardır.

1-Normal kemik yapısını ve kemik mineralinin dağılımını ça­lışmak için

2-Osteomalazi ve rickets gibi osteoid dokuda bir artışla sonuç­lanan normal kalsifikasyon sürecinin bozulduğu metabolik kemik hastalık­larının teşhisi için

Rutin olarak dekalsifiye edilmiş, parafine gömülmüş kemik kesitlerin­deki osteoidin differansiyel boyaması yeterli derecede güvenilir değildir veya teşhis için doğru değildir. Dekalsifiye edilmemiş kemik kesitleri aynı zamanda kemik büyüme merkezlerine lokalize olan tetrasiklin ve ilişkili antibiyotikle­rin araştırılmasında da kullanılmaktadır ve kesitlerde floresans mikroskopi ile gorülebilirler. Dekalsifiye edilmemiş kemiğin haraplanmamış kesitlerinin hazırlan­masındaki mevcut olan teknik zorluklar, bu amaç için birçok yöntem açık­lanmasına rağmen henüz tam olarak aşılamamıştır. Bunlar 3 grupta düşünü­lebilir:

1-Resine gömülmüş veya gömülmemiş kemiğin testere ile kesilme­si ve bilenerek öğütülmesi,

2-Selüloz nitrat-parafin çiftli gömme materyeline gömülmüş ma­teryalin sellofan bantlı veya selofan bantsız kesit alınması,

3-Ağır bir mikrotom ve bıçağı kullanarak resine gömülmüş kemiğin kesitinin alınması,

İkinci ve üçüncü yöntemler sadece küçük süngerimsi kemik parçaları için uygulanabilir.

TESTERELEME VE BİLEME YÖNTEMİ: Bu prosedürlerin bir kombinasyonu, erişkin uzun kemiğinin veya bir dişin transvers kesiti gibi dens kortikal kemik kesitlerinin hazırlanması için gereklidir. En basit formunda, yöntem ince bir testere ile kemikten ince bir dilim kesilmesi ve ardından bir bileme taşı veya % 70 lik alkol veya suyu lubrikant olarak kullanarak silikon carbide cilası ile önceden keskinleştirilmiş (pürüzsüzleştirilmiş cam plaka tabakaları arasında elle bilemekten ibarettir. Kesit daha sonra yıkanır, kurutulur ve lama aktarılarak kapatılır.

Daha emekli işlemlerde ise diş ve kemik kesitleri, mühendislerin torna-freze makinalarıyla veya bir mekaniksel bileme aygıtı ile sentetik resine gömülmüş veya gömülmemiş bloklardan hazırlanır. İstenilen özel aletlerden daha önemlisi kesitin final kalınlığının preperasyon sırasın­da 10 katı (ve bazen daha fazla) kaybolarak israf olmasıdır. Bununla be­raber, böylesi bir yöntemin uygulanması (günümüzde) dekalsifiye edilmemiş kompakt kemiğin ince kesitlerinin ve olgun dişlerin preperasyonları için gereklidir.

SELOFAN BANT YÖNTEMİ: Bu yöntem laboratuvarlarda daha gönül rahat­lığı ile uygulanabilir ve herhangibir özel aygıta gereksinim de yoktur. Sadece spongioz kemiğin küçük parçaları için (10x5x3 mm) için uygundur ve sıklıkla ilyak krista biyopsileri için histopatolojide kullanılmaktadır. Yöntemde transparan bir selo­fan bant şeriti, dekalsifiye edilmemiş kemiğin kırılmasını ve bükülmesi­ni önlemek için parafin bloğun yüzeyine yapıştırılır. Selofan bant kesitten, lama monte ettikten sonra ve boyamadan önce uzaklaştırılır. Plastik selofan bant yerine zamklı kağıt da kullanılabilir.

1-Selofan Bant Yöntemi ( Ball tarafından modifiye edilmiş-1957 )

% 10'luk nötral formal-salin ile 12-24 saat yapılır,

%70, % 90 ve üç değişim absolu alkol ile dehidre edilir.

Metil benzoat ile hazırlanmış % 3'lük LVN 'de herbirinde 4 saat olmak üzere iki değişimi ile impregne edilir.

Metil benzoat ile % 20 ‘lik LVN'de bir gece bırakılır.

Dokunun etrafından selüloz nitratın fazlası uzaklaştırı­lır ve 3 değişim toluende herbirinde ikişer saat bırakılır.

Parafin banyosuna (56⁰ C) aktarılır, iki değişim yapılır ve herbirinde 1 saat tutulur. Üçüncü parafinde ise 1 gece bırakılır. Ertesi sabah taze parafinle gömülür.

Blok ağır bir mikrotoma dikkatli olarak yerleştirin ve trim bıçağı ile yüzeyini açın. Trim bıçağını çıkarıp çok keskin, D-profil tipindeki bir bıçağı yerleştirin. Mikrotomu 8 µm ye ayar­layın. Selofan bantın dar olan yapışkan kısmının 25 mm lik bölümünü bloğun üzerine spesimenin ilerisine doğru uygulayın. Selofan bantın bu serbest ucunun kaldırılması bıçağın ağzını temizler, kesit kıpırdatmadan fakat kuvvetli bir hareketle alınır. Selofan bant bloğa tekrar uygulanır ve daha sonraki kesit alınır ve böyle böyle tekrarlanarak ke­sitler alınır. Selofan bantın bir kısmına yapışmış olan ke­sitler selofan bant şeritinden bir makas yardımıyla kesilir ve yumur­ta akı sürülmüş lam üzerine sıkıca yapıştırılır. Kesitlerin lama yapış­ması için 20-30 dakika sıcak plaka üzerinde tutulur. Selofan bantın yapışkansız kısmı suda çözünür ve ıslak kurutma kağıt şeritleri ile kısa bir zaman sonra uzaklaştırılır. Yapışkan kısmı ise daha zor uzaklaştırılır ve lamın ılık benzen veya toluen veya bunların 60 ⁰C de kapalı şişedeki karışımı ile batırıp ıslatmaya gerek­sinimi vardır. Yapışkan kesitten çözünüp ayrıldığında kesit, boyama için hazırdır fakat ince bir selüloz nitrat filmi ile kaplanması ay­rılmaya karşı bir önlem olarak avantaj olabilir.

Açıklamalar:

1-Bant kullanımı çiftli gömme yapılmış materyele bir avantaj sağlamaz.

2-Dekalsifiye edilmemiş kemik kesitlerinin incelenmesi için özellikle yararlıdır. Bunlar: a-Polarize ışık ile inceleme için boyanmamış bir kesit

b-H&E ile boyanmış kesit,

c- Kalsiyumu göster­mek için von Kossa boyası

Resine Gömülmüş Dekalsifiye Edilmemiş Kemikten Kesit Alma: Kemik trabeküllerinin bazı çatlaklarının ortaya çıkmasına rağmen parafine gömmeye nazaran doku desteği ve korunması daha iyidir. Aşağıda açıklanan basit metil metaerylat gömme tekniği güvenilirdir ve başarıyla geniş bir kullanıma sahiptir. Yöntem, mikrotom yöntemin­den başka testereleme ve bileme yapılacak dokular içinde uygulanabi­lir. % 10' luk nötral formal-salin ile en az 24 saat, tercihan ise 48 saat tespit edilir.

Metil Metacrylatın Hazırlanması: Ticari olarak bulunan metil metacry­lat monomeri inhibitör olarak hidrokinon (quinol) içermektedir ve hidrokinon, kullanımdan önce eşit miktardaki metil metacrylat ile % 5' lik sodyum hidroksit bir ayırma hunisinde birkaç dakika çalkalayarak uzaklaştırılır. Bu işlem 2 kez tekrarlanır ve daha sonra 3 kez dis­ti le su ile yıkanır. Yıkanmış monomeri anhidros kalsiyum klorür için­den geçirerek filtre edilir. + 4 C 'de buzdolabında ağzı sıkıca kapalı bir şişede tek tabakalı olarak saklanır. Gömme için metacrylatı kısmen polimerize etmek için, 100 cc' ye 1 gr kuru benzoyl peroksit eklenir ve geniş bir erlene aktarılarak sıcak su banyosuna yerleştirilir ve şurup kıvamına gelene kadar devam­lı çalkalanarak dikkatli olarak ısıtılır. Kesinlikle ısının 85 C' nin üstüne çıkmasına müsaede edilmemelidir. Metacrylat kalınlaştığında, erlen hemen soğuk su altına konularak soğutulmalıdır. Sonra şişeye ak­tarılıp buzdolabında saklanmalıdır. Aşağıdaki işlemler 20x10x5 mm'ye kadar olan küçük süngerimsi kemik parçaları için uygundur. Daha büyük örnekler için daha uzun iş­lemlere gereksinim olacaktır.

1-% 70'lik alkolde 8 saat

2-% 90'lık alkolde 1l gece

3-Bir gün boyunca 3 değişim absolü alkol

4-Metil metacrylat ile absolü alkol eşit hacimlerde karıştırılır ve 1 gece bu karışımda bekletilir.

5-Metil metacrylat monomerinde bir gün boyunca bekletilir.

6-Doku, ince duvarlı, tıpalı cam tüpteki kalınlaşmış monomere aktarılır. Tüp küçük bir su tabağına yerleştirilerek 35-40 ⁰ C de 2-3 günde polimerize edilir.

7-Metacrylat sertleştiğinde, inkübatörden çıkarılarak cam tüp kırılır, blok bir kesici ile trimlenir.

8-Kesit almak için keskin, kalın bir bıçak ve vibrasyonsuz bir mikrotom gerek­lidir. Jung KM mikrotomu ve 4 nolu bıçak özellikle uygundur. Bilinen mikrotomlarda ise W-edge veya D-profil bıçaklar kullanılmalıdır.

a-Bloklar direkt olarak mikrotom takozuna tutturulmalı,

b-Kesitler, 6-8 mikron olarak yavaş, sarsmadan kesilmeli,

c-Hem bıçak hem de blok için lubrikant olarak % 70' lik alkol kul­lanılmalıdır.

d-Kesitler boyanmadan önce % 70'lik alkole alınmalı ve orada sak­lanmalıdır.

e-Blok kuru olarak saklanmalıdır.

DEKALSİFİYE DOKUDA OSTEOlD'İN GÖSTERİMİ: Tespitte absolü alkol önerilmektedir fakat nötral formal-salin de kullanılmaktadır. Ancak gümüş nitrat çözeltisine aktarılma­dan önce distile suda serbest formaldehitin uzaklaştırılması için yıkanmalıdır. İnce, 1-2 mm^'lik kemik parçaları gerekli­dir.

Teknik

Doku birçok değişimler yaparak distile suda 4 saat yıkanır.

% 2'lik sulu gümüş nitrat içinde tamamen karanlıkta 4-8 saat tutulur.

Üç değişim distile suda herbirinde 15-20 saniye çalkalanır.

Dört saat akarsuda yıkanır.

48 saat indirgeme çözeltisinde bırakılır (sodyum hipoposfit 5 gr, 0.1 N sodyum hidroksit 0.2 cc, distile su 100 cc)

Çeşme suyunda 1 saat yıkanır.

% 5' lik sodyum thiosülfatta (anhidros) 24- saat bırakılır.

Akarsuda 1 saat yıkanır.

% 10' luk formik asitte dekalsifiye edilir.

Sudan kurtarılıp rutin parafine gömme işlemleri ile gömülür.

Kesitleri 5 mikron kesilir ve bir yapıştırıcı ile lama kapatılır.

Kesitler suya indirilir ve Van Gieson boyası ile 2 dakika boyanır.

Dehidre edilip, şeffaflandırarak sentetik resinli bir ortam ile kapatılır.

Sonuçlar: Osteoid kırmızı, minarilize alanların sınırları siyah, kemik matriksi sarıdan kahverengi-siyaha kadar

KEMİK İLİĞİ: Kemik iliği filmlerinden ve smearlerinden, kesitlere göre daha fazla bilgi edinilir. Filmlerdeki gibi kesitleri boyamak kolay de­ğildir. Kesitlerdeki hücreler daha küçüktür. Tanımak ve Romanowsky renklerini de elde etmek zordur. Kesitlerin avantajları, daha fazla titizlikle ilik hücreselliğini ölçümleyebilmek ve hücrelerin yapılarını koruyabilmektir.

ASPİRE EDİLMİŞ KEMİK İLİĞİ: Bazen, sadece kemik iliği kesitlerinin araştırılması (incelenmesi) myelofibrosis, aplastik anemi veya sekonder karsinoma gibi hastalıkların teşhisini doğrulayacaktır. Aspire edilmiş örnek­ler fiksatife aktarılana kadar sıvı olarak muhafaza edilmeli ve son­ra aşağıdaki gibi işleme konulmalıdır.

Teknik

1-2 cc’lik ilik bilinen yolla hızlı aspirasyonla alınır ve direkt olarak temiz bir lama alınarak ezilerek yayılır. Geriye kalan kemik iliği 6 damla Wintrobe’in oksalat karışımını içeren (sequestrene ve heparin bu amaç için daha az güvenlidir) saat camına konur. İlik partikülleri Pastör pipeti ile yaklaşık olarak 3 cc asetik asit-formalin içeren küçük bir şişeye aktarılır.

Asetik asit-formalin;

Formalin 10 cc

Glasial asetik asit 5 cc

Distile su 35 cc

Örnek laboratuvara bu şişede götürülür. Fiksasyon için 2-4 saat bırakılmalıdır. Laboratuvarda küçük şişenin tüm içeriği 10 cc % 70' lik alkol içeren bir şişeye aktarılır ve karıştırılır. İlik fragmentleri şişenin di­bine batar ve yağ parçacıkları ise şişenin yüzeyinde yüzer. Birkaç dakika sonra, çok ince bir Pastör pipeti kullanarak tabandan ve yüzey­den hiçbir partikül olmamasına dikkat ederek orta kısımdan alınır. Fragmanları sigara kağıdı üzerine alıp, küçük bir zarf biçiminde kat­lanır. Zarf, bir kaset ya da biopsi sepetine yerleştirerek takibe alınır. Ototeknikonda takip yapılır. Eğer sadece bir veya iki ince fragman varsa, takip teknik tüp tekniği ile değiştirilmelidir. Tüpte takip yapılırken ince Pastör pipeti kullanılmalıdır. Her iki durumda da aşağıdaki takip önerilmektedir.

% 70' lik alkol 60 dakika

% 95' lik alkol 30 dakika

% 100' lük alkol (herbirinde 4 değişim yaparak) 30 dakika

3 değişim toluen 15-30 dakika

3 değişim erimiş parafin 30 dakika

Örnek önceden gliserol ile çalkalanmış 7.5X1.25 cm'lik tüpte taze eritilmiş parafine aktarılır. Tüp birkaç dakika partiküllerin çökme­sini sağlamak için parafin fırınına koyulur.

Fırından tüpü çıkarıp mümkün olduğu kadar kısa sürede partiküller tübün tabanında gömülmüş olduğundan dik tutmaya gayret ederek soğutu­lur.

Tüp dikkatli olarak kırılır.

Kırıkları atılır.

Gerekli ise trimlenir.

Mikrotom takozuna tutturulur,

Dokuzar kesitlik seri kesit alınır.

Aşağıda açıklandığı gibi boyanır.

AÇIKLAMA: Kemik iliğinde malign hücreler araştırılacağı zaman, ilik fragmanları bir plas­tik precipitin tübüne konulur, santrifüjlenir. Süpernatan plazma atılır, fiksatif eklenerek tüp yeniden santrifüjlenir. Fiksasyondan sonra, tüp kloroform ile eritilir ve doku yukarıda açıklanan bilinen zarflama yolu ile hazırlanır.

KEMİK İLİĞİ BİYOPSİLERİ: Nötral formalin veya asetik asit-formalin fiksasyonu çoğu boyama yöntemi için tatminkar ve uygundur. Kuvvetli asitlerdeki dekalsifikasyonunun fazlalığı rutin yöntemlerle zayıf boyamaya neden olmaktadır ve Romanowski teknikleri güvenilmez ya da olanaksızdır. Parafin gömme genellik­le tatminkardır.

KEMİK VE KEMİK İLİĞİNİN BOYANMASI: Erlich Hematoksilen, kıkırdağın heteropolisakkarit içeriğini ve kemiğin sement çizgilerini, nukleusları boyamaktadır. Eozin zıt boyası ile birlikte kemik histolojisinde rutin yöntemdir. Ancak, Erlich hematoksileni Paget hastalığında sement çizgilerinin karekteristik ya­pısını göstermede özel bir değeri varsa da, kıkırdak-şekillenen tümörlerdeki bazofil materyelin kuvvetli boyanması bazen nüklear ayrıntıyı baskılıyabilir. Böyle vakalarda Gole, Mayer veya Harris hematoksilenini kullanmak tercih edilebilir. EDTA^'ta dekalsifiye edilen kemiğin hematoksilen ile uzun süre boyanmasına gerek yoktur ancak kuvvetli asit solüsyonlarda uzun süre dekalsifiye edilen materyel normal boyama süresinde boyanamayabilir. Böyle durumlarda, daha uzun boyama (distile suda 1:5 oranında seyreltilmiş hematoksilende 16-24 saat), demir hemateksilenin kullanımı veya celestine blue-hemalum boya sırası yararlı olabilir. Asitle dekalsifiye edilmiş doku eozini çok fazla alır ve solüs­yonun seyreltilmesi veya boyadan sonra uzun süre yıkama, kollajenin, olgun kemik ve osteoidin differansiyel boyamasını sağlamak için gerek­li olabilir.

1- Metacrylat Kesitler İçin Hematoksilen-Eozin Boyaması

Kesitleri % 70'lik alkolden distile suya aktarılır.

Gole hematoksileni ile 60 dakika boyanır.

Çeşme suyunda iyice yıkanır.

% 1'lik sulu eozinde 30 dakika boyanır.

Osteoid pembe, kalsifiye kemik koyu morumsu kahverengini alana kadar çeşme suyunda differansiye edilir.

Kesitler, % 70, % 90 ve absolü alkolden geçirerek sudan kurtarılır.

Kesitler Euparal'a aktarılır.

Kesitleri bir lama alınarak kesitler üzerine düz sert kağıt şeri­t uygulanır. Kağıt üzerinde bir cam çubuğu yuvarlayarak buruşukları açılır. Kağıt soyarak kaldırılır.

Euparal'da kapatılır. Lam üzerine kesitin düzleşmesi için küçük bir ağırlık konur.