Işik mikroskopik teknikler
NÜKLEİK ASİTLER VE NÜKLEOPROTEİNLER
Yüklə 0,49 Mb.
|
NÜKLEİK ASİTLER VE NÜKLEOPROTEİNLER Nükleoproteinler, nükleik asitlerin ve bazik proteinin kombinasyonlarıdır. DNA esas nükleer bileşendir diğeri ise RNA' dır ve hem çekirdekte hem de sitoplazmada bulunur. RNA kromozomlarda çok az bulunur. Nükleolusda ve ribozomda bulunur. Boyama yapılmış kesitlerde, ışık mikroskubunda RNA bazofilik granüller şeklinde görülebilir. Hücrelerin çoğunun sitoplazması kuvvetli asidofiliktir fakat plazma hücreleri çok fazla RNA içeriklerinden amphofilik (hem bazofilik, hem asidofilik) tirler ve H-E gibi rutin bazik ve asidik boyama yöntemi ile morumsu boyanırlar. Nükleik Asitlerin Boyanması:Nükleik asitler, fosfat–pentoz–purin/pirimidin baz bileşikleridir ve bu bileşenlerin herbiri histolojik yöntemlerle gösterilmelidir. Asidik fosfat radikalleri bazofiliden sorumludur ve bazik boyalar rutinde nükleik asitler için çok kullanılmaktadır. Bunlar NA’ya ek olarak diğer maddelerle de birleştiklerinden spesifik olmayacaklardır. Metil green’in DNA‘ya özel bir affinitesi vardır. Purin ve pirimidinler için geliştirilen Tetrazonium reaksiyonunun nükleoproteinler için non–spesifik olduğu gösterilmiştir. DNA’nın şeker yapısı asit hidrolizinden sonra, aldehit–Schiff reaksiyonu ile saptanabilir. Feulgen reaksiyonu DNA için tam ve spesifik bir testtir. Feulgen reaksiyonunun sonuçları; farklı durumdaki aldehitleri gösteren naftoik asit hidrazid-Feulgen metodu ile doğrulanabilir. RNA ise pyronin ve metil green pyronin tekniği ile bazı teknik zorluklara karşın gösterilebilir ve hem DNA hem de RNA için spesifik bir yöntemdir. Nükleik asitlerin hematoksilen gibi bazik boyalara kuvvetli bir affiniteleri vardır. Regressif hematoksilen boyama yöntemleri, özellikle de Heidenhein demirli hematoksilen, nükleusların ve kromozomların gösteriminde çok kullanılır. DNA ve RNA’nın fosfat grupları asidiktir ve hematoksilen ve diğer bazik boyalarla, tuz linkajları ile bağlanırlar. Rutin çekirdek boyası için çok kullanılırlar. RNA’ya özel bir affinitesi olan toluidin blue gibi (ph 5 de RNA’ya özel bir affinitesi vardır), safranin ve nötral red gibi bazı bazik boyalar nükleik asitlerin genel boyanması için kullanılırlar. Ancak, hematoksilende olduğu kesin sonuçlar vermezler. Nükleoluslar, bazofilik ve asidofiliktirler. Bazofili; yüksek nükleik asit içeriğinden, asidofili ise protein içeriklerinden dolayıdır. Asidik ve bazik boyalarla boyanma reaksiyonu, nükleik asitler ve proteinlerin birbirlerine oranlarına bağlıdır. Fiksasyonlar ve boyama çözeltilerin pH’sı ile etkilenebilir. Nükleoluslar, hematoksilen ve toluidin blue gibi bazik boyalarla boyanabilirler fakat Feulgen (-) tirler. Zıt boyama ile de yeşil olarak renklenirler. Pyroninofiliktirler ve metil green pyronin (Unna- Pappenheim) tekniği ile kırmızı olarak boyanırlar. Her zaman seks kromatini yöntemleri ile boyanmazlar. Nukleoluslar akrinidin orange ile kırmızı floresans verirler fakat ayrıntılar iyi değildir. Nukleoluslar en iyi- genel bazik boyama ve nukleolusları kromozomlardan ayıran Semmens ve Bhaduri tarafından geliştirilen nükleoluslar için Feulgen reaksiyonu medifikasyonu ile gösterilirler. Kromozomlar, histolojik kesitlerde görülebilir, fakat genellikle smearlerde çalışılır. Kromozom boyaları: a- Giemsa b-Orcein c- Heidenhein demirli hematoksilen Kromozom bantlama boyaları: a- Quenn acrin b- Acridin orange c- Giemsa d- Orcein e- Baryum hidroksit Y kromozomu: Floresans mikroskopta, özel boyamalar ile floresans vermesi ile saptanır. 1- DNA için Feulgen reaksiyonu: DNA için en güvenilir ve en spesifik tekniktir. Reaksiyon, asit hidroliz ile purin-deoksiriboz bağlarının kırılması ile aktif aldehit gruplarının serbest kalması esasına dayanmaktadır. Aldehitler, Schiff reaktifini (leucofuksin, fuksin sülforoz asidi) tekrar renklendirerek, çekirdek kromatinine mor-menekşe renk verir. Bu reaksiyon, PAS reaksiyonunun analogudur. Fiksasyon için Bouin, aşırı hidrolize neden olduğundan tavsiye edilmez. Diğer fiksatiflerin çoğu kullanılabilir fakat asit hidrolizin optimum süresi fiksatife göre değişmektedir. Fiksatifin penetrasyon hızı Feulgen reaksiyonunun yoğunluğunu etkiliyebilir. Hidroliz ise 1 N HCl ile 60 0C’de yapılır. Birçok alternatif hidrolize edici ajanlar kullanılabilir. Hidroliz, nükleik asitlerde 2 farklı değişikliğe neden olmaktadır. Purin bazlar hızla uzaklaşır ve deoksiribozun aldehit grupları açığa çıkar. Bu istenen bir harekettir fakat aynı zamanda bazik protein ve nükleik asitler kromozomlardan uzaklaştırılır. Yetersiz hidroliz, zayıf bir Feulgen reaksiyonu verirken aşırı hidroliz ise negatif sonuçlara yol açmaktadır. Pratikte kesitleri farklı hidroliz sürelerine maruz bırakarak optimal zamanın tayin edilmesi iyi sonuçlar vermektedir.
DNA morumsu - kırmızı Sitoplazma yeşil
DNA mavimsi – menekşe Sitoplazma ve diğer proteinler pembemsi – kırmızı
DNA (kromatin) ........................ yeşil veya mavi – yeşil RNA (çekirdekcikler) .................gül kırmızı
DNA...........mavi RNA .......... mavi
DNA (Çekirdekler)...............................................................yeşil RNA (nükleoluslar ve stoplazmik nükleik asitler )................kırmızı Fibröz doku .........................................................................yeşil Ortam ..................................................................................siyah
DNA ve RNA için boyama tekniklerinin spesifik kontrolu geride mukopolisakkaritler gibi diğer bazofilik maddeleri bırakarak nükleik asitlerin uzaklaştırılması ve denaturasyonunu sağlayan ekstrasyon yöntemleri ile yapılır. İki tip işlem vardır: Deoksiribonükleaz ve ribonükleaz’ın kullanıldığı enzimatik işlem, kuvvetli asitlerin kullanıldığı kimyasal işlem Uygulama Yöntemleri: Ribonükleaz ekstrasyon teknikleri RNA ....................ekstrakte olur DNA.....................etkilemez Asidik ekstrasyon Yöntemleri:Perklorik asit ( HClO4) hem DNA’yı hem de RNA’yı ekstrakte eder. Fakat RNA daha hızlı uzaklaşır. Trikloroasetik asit hem DNA’yı hem RNA’yı uzaklaştırır fakat differensiyel ekstrasyon için uygun değildir. DNA, Bouin sıvısındaki hidroliz ve anilin ile muamele ile de ekstrakte olabilir. Diğer ekstrasyon yöntemleri: Safra tuzları ile nükleik asitler ekstrakte olur. İNTERMEDİET FİLAMANLARIN GÖSTERİMİ SİTOKERATİN VE VİMENTİN BOYAMA YÖNTEMİ (APAPP Yöntemi ) 1-Önceden soğutulmuş 50:50 metanol / aseton fiksatifinde 1.5 dakika fikse edilir. 2-pH=7.6 olan Trisle tamponlanmış salinde 5 dakika yıkanır. 3- 1:400 oranında seyreltilmiş yaklaşık olarak 30 ml ICL fare antihuman monoklonali ilk antikor olarak uygulanır. Oda ısısında 2 saat bırakılır. 4- Trisle tamponlanmış salinde 5 dakika yıkanır. 5-1:20 oranında seyreltilmiş 30 ml tavşan anti fare (RAM) poliklonal 2 antikoru uygulanır. Oda ısısında 30 dakika inkübe edilir. 6- Trisle tamponlanmış salinde 5 dakika yıkanır. 7-3 ml APAPP 30 dakika uygulanır. 5-6 ve 7. işlem basamakları tekrarlanır. 8-Beş dakika yıkanır. 9-Filtre edilen substrat (hazırlanışı aşağıda verilmiştir ) uygulanır ve 15 dakika beklenir. 10-Çeşme suyunda yıkanarak hematoksilen ile zıt boyama uygulanır.
Naphtol AS phosphate........................2 mg Dimetilformamide................................0.2 cc M TRİS tamponu (pH=8.2)................9.8 cc M Levamisole....................................10 ml Fast Red-TR Base..............................10 mg BAĞ DOKUSU BOYALARI Bağ dokusu fibrillerinin differensiyal boyama işlemleri, histolojik tekniklerin önemli bir kısmını oluşturur. Bu yolla dokulardaki patolojik değişimlerin saptanmasında yararları vardır. Fibriller farklı boyaların kombinasyonlarla veya ardarda kullanımları ile gösterilebilir. Metalik çöktürme yöntemleri de retiküler fibriller için uygulanmaktadır. 5-6 µm den daha kalın olan kesitler bağ dokusu fibrilleri için uygun değildir. Herhangibir trikrom boyası için 3-5 µm’luk parafin kesitler kullanılmalıdır. Van Gieson boyası için kollajen fibrillerin gösteriminde daha kalın kesitler kullanılabilir. Kollajen Fibrillerin Gösterimi a-Van Gieson Boyası:Kollajenin seçici boyanması için kullanılan en basit yöntemdir. Dezavantajı, genç fibrilleri koyu kırmızı boyamamasıdır. Kollajeni koyu kırmızı,kas, sitoplazma, kırmızı kan hücreleri, fibrin sarı renkte boyanır. Asit fuksinle kırmızı boyanır. b-Masson’ un trikrom boyası:Özellikle Zenker, Helly, Bouin ve formal-sublimat ile fiksasyon önerilir. % 10 luk formalin ile tespit edilmiş kesitler 3 saat kadar %3'lük civa klorür içeren doygun alkolik pikrik asitle pikrik asit boyamasını uzaklaştırmak için yapılan yıkamayı takiben mordantlanabilir. Sonuçlar:Kas, eritrositler, fibrin ve bazı sitoplazmik granüller kırmızı; kollajen, bazı retiküler fibriller, amiloid ve mucin fibril boyası için anilin blue kullanılmışsa mavi; light green kullanılmışsa yeşil olarak boyanır. c-Mallory boyası: Masson' un trikrom boyası Mallory tarafından asit fuksin-anilin blue-orange G yöntemi ile geliştirilmiştir. Bu iki yöntem, çok sayıdaki polikrom kombinasyon boyama yöntemleri için standart olarak alınabilir. Mallory boyasındaki asit anilin boyası olan anilin ile kollajen lifler mavi olarak boyanmaktadır. d-Gomori’ nin hızlı tek basamaklı trikrom boyası: Masson ve Mallory yöntemleri geliştirilerek tek basamaklı trikrom boyalar uygulamaya girmiştir. Bunlar çeşitli boyaları tek bir çözelti içinde bir araya getirir ve bu yüzden de işlem basamakları azalır. Bu yöntemlerden en iyi sonuç verenlerinden biri Gomori'nin hızlı tek basamaklı trikrom boyasıdır. Sonuçlar: Kollajeni yeşil; kas, sitoplazma, eritrositler ve fibrini kırmızı boyar. Retiküler Bağ Dokusu ve Retiküler Fibrillerin Gösterimi:Retiküler bağ dokusu, lenforetiküler ve miyeloretiküler sistem gibi hücreden zengin dokuları ve organları ince dallarıyla destekleyen retiküler fibrillerden oluşmaktadır. H-E ile gösterilemezken, bazıları Masson' un trikrom yöntemi ve benzer yöntemlerle gösterilebilirler. PAS reaksiyonu pozitiftir (% 6-12 oranında hekzoz içerirler) ve argirofiliktirler. Tam olarak gösterilebilmeleri için gümüş çöktürme yöntemleri uygulanmalıdır. Kollajen gibi, retiküler fibriller de otolitik değişikliklere dirençlidir ve gümüş çöktürme yöntemleri, rutin boyama yöntemlerinin herhangibir detay vermediği otoliz olmuş veya enfarkte olmuş dokularda yararlıdır. Gümüş yöntemlerinde cam malzemeler kimyasal olarak temiz, reaktifler ise saf olmalıdır. Amonyak çözelti taze, kurşun içeriği düşük olmalı ve % 35' lik çözelti kullanılmalıdır. Bu çözelti, kuvvetli amonyak olarak adlandırılır. Amonyaklı gümüş çözeltilerinin patlayıcı olduğu unutulmamalıdır.
1-Hart modifikasyonu 2-Sheridan resorsin kristal viyole yöntemi 3-Dahlia, resorsin, ferric nitrat elastik doku boyası e-Dahlia-resorsin yöntemi: Elastik fibriller mavi/siyah boyanır. Bu yöntemde dahlia boyası yerine metil viyole, etil viyole, victoria blue ve thionin gibi katyonik boyalar da kullanılabilir. f-Aldehit fuksin yöntemi: Ilk kez Gomori tarafından uygulanmıştır. Hem ince hem de kalın fibriller boyanmaktadır. Elastik fibrilleri, pankreas beta hücre granüllerini, bazı mukosubstansları, bazı fungusları, kıkırdak matriksi ve mast hücre granüllerini mavi/mor renkte boyar. ALDEHİT FUKSİN (Elastik doku, mast hücreleri pankreas b hücreleri için) % 70 Alkol .............................100 cc İodine cristals.........................0,5 gr Sodyum thiosulfate .................0,75 gr % 96 Alkol ..............................10 cc Distile su .............................. 90 cc Bazik fuksin ............................0,5 gr %70 Alkol ...............................100 cc Konsantre HCI .....................1 cc Paraaldehit.............................1 cc Bazik fuksin alkolde çözülür. Asit ve paraaldehit eklenerek iyice çalkalanır. Çözeltinin rengi menekşe olana dek 24 saat beklenir. Oda sıcaklığında 4 hafta dayanıklıdır.
1-Ksilol
2-Ksilol 3-% 100’lük etil alkol 4-%90’ lık etil alkol 5-A çözeltisinde 10 dakika ile -1saat boyanır. 6- Su ile iyice yıkanır. 7-B çözeltisinde 1,5-2 dakika bekletilir. 8-Suda ile iyice yıkanır. 9-C çözeltisinde 15-30 dakika boyanır ( Hipofiz 30 '-2 saat ) 10-Hematoksilen veya Orange G ile zıt boyama yapılabilir. 11-Alkolde dehidre edilip, ksilolle şeffaflandırma ve kapanır. g-Pikrik asit: Elastik lifler sarı renkte boyanır. h-Safranelin: Elastik lifler kırmızı renkte boyanmaktadır. Maskar Boyası: Kollajen ve elastik liflerin aynı anda gösterilebildiği Üveis Maskar tarafından geliştirilmiş bir yöntemdir. İki şekilde uygulanır. 1- Mallory'nin asit anilini ile kollajen lif ................................mavi safranelin ile elastik lif..................................................... kırmızı 2-Naftol green B ile kollajen lif .............................................yeşil Safranelin ile elastik lif ......................................................kırmızı boyanmaktadır. CURTIS'IN PICRO-PONCEAU BOYASI A çözeltisi: Weigert hematoksileni B çözeltisi : % 70' lik alkol ile hazırlanmış % 1' lik HCl C çözeltisi : Picro-Ponceau karışımının hazırlanışı % 1' lik Ponceau S' in sulu çözeltisi 10 cc Suda doyurulmuş pikrik asit 90 cc Glasial asetik asit 1-2 cc
1- Kesitler suya kadar indirilir. 2-Weigert hematoksileni ile 15-20 dakika boyanır. 3- Akarsuda enaz 5 dakika boyanır. 4- Asit-alkol karışımı ile 5-10 saniye ( 100 cc %80'lik etil alkol, 1 cc HCl ) 5-Akarsuda en az 10 dakika yıkanır. 6-Picro-ponceau ile 2-5 dakika boyanır. 7-Akarsuda çalkalanır. 8-Hızla dehidre edilir, şeffaflandırılır ve kapatılır.
Kollajen ..................kırmızı Çekirdekler ..............gri Diğer yapılar ...........sarı Van Gieson' un modifiye şekli olan Curtis boyası rutinde ponceau S asit fuksinden daha kalıcı olduğu için tercih edilmektedir.
% 1' lik sulu asit fuksin 10 cc Suda doyurulmuş pikrik asit ........100 cc Curtis' in yöntemi ile aynıdır. Picro-ponceau yerine 2-5 dakika Van Gieson pikro-fuksini kullanılır. Asit fuksin daha açık pembemsi kırmızı verir. Ponceau S ise kısmen kahverengimsi kırmızı renk verir. WEIGERT' İN ELASTİK LİF BOYASI ( HART MODİFİKASYONU) Elastik lifleri göstermek için mükemmel bir boyama yöntemidir, ancak yavaştır. Hızlı bir çalışma için Verhoef' in yöntemi veya aldehit fuksin kullanılır. Parafin, selüloz nitrat ve frozen kesitler için uygundur. A: Weigert' in stok çözeltisi Resorcin-fuksin 1.5 gr . % 95' lik alkol 200 cc Konsantre HCl 4 cc Sıcak su banyosunda 20 dakika kaynatılır. Buharlaşmayı azaltmak için uzun boyunlu bir kap seçilmelidir. Soğutulur, birkaç ay saklanabilir. B: % 70' lik alkolle hazırlanmış %1' lik HCl C: Çalışma çözeltisi Weigert' in stok çözeltisi 5-20 cc Çözelti B 45-30 cc Toplam 50 cc D: Harris hematoksileni E: Curtis' in picro-ponceau karışımı Uygulama 1- Kesitler suya indirilir. 2- Alkolde çalkalanır. 3- Çalışma çözeltisinde bir gece ağızı kapalı olarak bırakılır. 4- Asit-alkolde çalkalanır (100 cc % 80'lik etil alkol, 1 cc HC1) 5-Akarsuda 10 dakika çalkalanır. 6-Harris hematoksileni ile 10 dakika boyanır. 7- En az 5 dakika akarsuda yıkanır. 8- Curtis' in picro-ponceau karışımında 2-5 dakika boyanır. 9- Hızla suda çalkalanır. 10- Dehidre edilir, şeffaflandırılır ve kapatılır.
Elastik fibriller ...................siyah Kollajen fibriller .................kırmızı Çekirdekler ........................gri Diğer yapılar ......................sarı
A:Mercury choride' nin suda doymuş çözeltisi B:Verhoef in elastik boyası % 20 alkolik hematoksilen 5cc Alkol 15cc % 10' luk suyla hazırlanmış ferrik chloride 8 cc Lugol' ün iodine çözeltisi 8 cc Bu karışım taze kullanılmalıdır. Lugol ' ün iodine çözeltisi İodine kristalleri 1 gr Potasyum iodide 2 gr Distile su 100 cc C: % 2 lik sudaki ferric chloride D: Curtis’ in picro-ponceau boyası Uygulama 1- Kesitler suya indirilir. 2- Mercury chloride ile 30 dakika ağzı kapalı kapta bırakılır. 3-Suda çalkalanır. 4- Verhoef ile 15-30 dakika boyanır. 5- Suda çalkalanır. 6- Elastik fibriller belirinceye kadar ferrik chloride ile differensiye edilir. 7- Akarsuda 2-3 dakika yıkanır. 8- Alkolde 5-15 dakika kadar iodine gidene kadar çalkalanır. 9- Akarsuda 5 dakika yıkanır. 10- Picro-ponceau ile 2-5 dakika boyanır. 11- Suda biraz çalkalanır. 12- Hızla dehidre edilir, şeffaflandırılır ve kapatılır.
A:Orcein:100 cc % 75 lik alkole 1 gr orcein katılarak çözülür. 0.7 cc derişik HCl ilave edilir. B: Pikro-fuksin:100 cc sulu doymuş pikrik asidin içerisine 0.1 gr asit fuksin ilave edilerek hazırlanır.
1- Kesitler distile suya indirilir. 2- Orcein ile 3 saat 37-40 derecede etüvde boyanır. 3- Distile suda çalkalanır. 4- Pikro-fuksinde 30 saniye tutulur. 5- Distile suda yıkanır. 6- a: % 100' lük alkolde 3 dakika b: % 100' lük alkolde 5 dakika c: % 100’ lük alkolde 5 dakika 7-Ksilol ile şeffaflandırıp kapatılır. VAN GİESON BOYASI Çözeltinin Hazırlanışı A: 1 gr demir alum (ferrik amonium sülfat) 50 cc distile suda çözülür ve 0.8 cc sülfürik asit ilave edilir. B: %90-96' lık alkolden 50 cc alınır ve 500 mg hematoksilen çözülür. A ve B solusyonları karıştırılarak süzülür. C: Pikro-fuksin: Suda doyurulmuş pikrik asitten 100 cc alınıp, 0.1 gr asit fuksin ilave edilir. Uygulama 1- Kesitler suya indirilir ve distile suda 3 dakika tutulur. 2- Hematoksilenli karışımla 3 dakika boyanır. 3- Akarsuda 3-5 dakika yıkanır. 4- Pikro-fuksin ile 10 dakika boyanır. 5- a: % 75'lik alkolle 3 dakika b: % 96’lık alkolle 3 dakika c: % 100'lük alkolle 10 dakika 6- Şeffaflandırıp kapatılır.
A:Azocarmin G Çözeltisi: 250 cc distile suda 250 mg azocarmin çözülür ve 5 cc glasial asetik asit eklenir. B:Anilin Alkol Çözeltisi: 100 cc % 70 veya 96' lık alkol içine 1 cc anilin oil eklenir. C: Asetik Asit-alkol Çözeltisi: 100 cc % 96' lık alkole 1 cc asetik asit ilave edilir. D:Fosfotungustik Asit Çözeltisi: 100 cc distile suda 5 gr fosfotungustik asit çözülür. E: Heidenhein’s Blue Boyası: Anilin blue 0.5 gr, orange G 2 gr 100 cc distile suda ısıtılarak çözülür. Soğuyunca 8 cc asetik asit eklenir. Kullanılmadan önce 1 hacim boyaya 2 hacim su katılarak seyreltilir. Uygulama 1- Kesitler suya indirilir. 2- Azocarmin G ile 60 derecelik etüvde 1 saat boyanır. 3- Distile suda yıkanır. 4- Anilin-alkolle kırmızı boya akışı duruncaya kadar hafifce çalkalanır. Çekirdekler kırmızı , sitoplazma açık pembe olmalıdır. 5- Asetik asit-alkol ile 30 saniye veya 1-2 dakika bekletilir. Kırmızılık geçmezse tekrar anilin yapılır. 6-Distile su ile yıkanır. 7- Fosfotungustik asit ile 30 dakika ile 1-3 saat kadar işleme tutulur. 8- Heideinhein’s blue ile 30 dakika boyanır. 9- Alkollerle dehidre edip, şeffaflandırıp kapatılır. Yüklə 0,49 Mb. Dostları ilə paylaş:
|