Işik mikroskopik teknikler

SONUÇLAR

Argirofil hücreler.......siyah

Çekirdekler…………kırmızı

AÇIKLAMALAR:Altıncı basamak uygulanırken kesitlere mikroskop altında bakılır, gerekli ise impregnasyon süresi uzatılabilir. Bu yöntemle arjentaffin hücreler de boyanabilir.

APUD HÜCRELERDE AMİNLERİN GÖSTERİLME YÖNTEMLERİ

Dokulardaki biyolojik aminlerin gösterilebilmelerinin temeli, aminlerin aldehit­lerle ve bazı asitlerle birleşerek spesifik floresans yayan ve spektrum yayan bileşik­leri üzerine gözlemlere dayanmaktadır. Bu bileşiklerden bazıları aynı zamanda indirge­yici ajandır. Çoğu biyolojik amin, bulundukları hücreden hızla yayılırlar, bu yüzden aminleri hücre içinde gösterebilmek için freeze drying ve vapour fiksasvon teknikleri uygulanmalıdır; birçok aminler için (örnek histamin), formaldehit buharı fiksatif seçimi değildir ve 0-phthaldialdehyde gibi daha kompleks bileşikler patologlar için en önemli aminlerden biri olan 5-hidroksitriptamin dolu granüllerinden kısmen daha yavaş yayılır ve bir beta karbolin oluşturmak üzere paraformaldehit buharı veya formaldehitin sulu solüsyonu ile kolayca birleşir. Beta karbolinin absorbsiyon piki 410 nm de, emisyon piki ise 525 nm dir ve parlak sarı floresans verir. 5-HT in en iyi inceleme yöntemlerinden birisi bunu bir boyanmamış kesitte gözlemektir. Bu formaldehit-induced floresans tekniğidir. Bi­yolojik amin olan DOPA' yi içeren melanin-üreten hücrelerde de uygulanmaktadır. Eronko yöntemi de sıklıkla uygulanmalıdır.

Beta karbolin indirgeyici bir ajandır ve gümüş tuzlarını metalik gümüşe veya ferriciyanidi ferrocyanide indirgeyecektir (Schmorl reaksiyonu-Bancroft sayfa252). Aynı zamanda da diazonium tuzları ile çözünemeyen renkli bir azo boyası oluşturmak üzere birleşir. Her iki reaksiyonda çok kullanılmaktadır. Teorikte, her biyolojik amin, al­dehitle floresans veren bir bileşik oluşturmak üzere bağlanabilir. Fakat pratikte fiksasyonun ve takibin normal şartlarında sadece 5-HT görülebilen sonuçlar verir. Pozitif boyanma için erken ve uygun bir fiksasyon yapılmalıdır. Post-mortem dokular iyi sonuç ver­mez.
MASSON-HAMPERL ARJENTAFFİN TEKNİĞİNE SİNGH' İN MODİFİKASYONU

(Singh, 1964)

Fiksasyon: Formaldehit, gluteraldehit veya pikrik alkol

Kesitler: Parafin

Çözeltinin Hazırlanışı: %10’luk gümüş nitrata 0.880 amonyağı çökelti kaybolana kadar ekleyin. Bu şeffaf çözeltiye % 10' luk gümüş nitrat damla damla ince bir kalıcı opalesce edilene kadar damla damla eklenir. Her 1 cc gümüş çözeltisi için 9 cc distile su ekle­yiniz.

YÖNTEM

1-Kesitleri suya indirin

2-Birkaç kez ayrı kaplardaki distile su ile iyice çalkalayın
3-Önceden 60 dereceye ısıtılmış gümüş çözeltisinde 15-30 dakika bırakın

4-Distile suda çalkalayın

5- 1 dakika % 1^’ lik sodyum tiyosülfat çözeltisinde tespit edin

6-Distile suda yıkayın

7-Artan dereceli alkol serilerinde dehidre edip, ksilolde şeffaflandırın

8-DPX ile kapatın

Sonuçlar: Arjentaffin hücreler siyah granüller içermektedir.

Kesitler beşer dakikalık aralıklarla kontrol edilmelidir. Açık kahverengi oldukların­da çıkarılmalıdır.

ALKALİN DİAZO YÖNTEMİ (Gomori, 1952)

Fiksasyon: Formaldehit

Kesitler: Parafin tercih edilir.

İnkübasyon Çözeltisinin Hazırlanması

% 1’lik fast red B............................................5 cc

Suda doyurulmuş lityum karbonat.......................2 cc

Bu iki çözelti karıştırılmadan önce + 4 C’ de saklayın. Daha sonra karıştırıp hemen kullanın.

YÖNTEM

1.Kesitleri suya indirin

2-Kesitleri l dakika 4 derecede inkubasyon çözeltisine aktarın

3-Çeşme suyunda iyice yıkayın

4- Hematoksilen ile çekirdekleri hafifçe boyayın

5-Çeşme suyunda iyice yıkayın

6-Artan dereceli alkol serilerinden geçirip dehidre edin ve ksilolle şeffaflandırın

7-DPX ile kapatın

SONUÇLAR

Arjentaffin hücre granülleri.......oranj

Çekirdekler……………………..mavi

Ortam……………………………sarı

AÇIKLAMALAR: Fast Garnet GBC gibi diğer diazonium tuzları kullanılabilir. Bu teknik sadece taze tespit edilmiş materyel ile başarılı olur, nadiren nekroskopik materyelle pozitif sonuçlar verir.

POLİPEPTİT HORMON GÖSTERİMİ

Endokrin hücre granüllerindeki polipeptit hormonları birkaç yöntemle göstermek olasıdır.

Elektronmikroskobik Görünümler: İmmünositokimyasal tekniklerle özel bir polipeptid içerdiği gösterilebilen granüllerin granül büyüklüğü, şekli ve densitesi olmak üzere özel bir ultrastrüktürel görünüme sahip olmaları ile tanınabilirler. Ultrastrüktürel görünümlerle osmium kullanmadan alde­hitle tespit edilip resine gömülmüş dokulardan alınan yarı ince-ince kesit tekniği kul­lanarak elde edilen immunositokimyasal bulgular arasında korelasyon kurulabilir. Yarı ince kesit 1-2 mikron olarak kesilir ardından birkaç tane ince kesit onun da ardından bir yarı ince kesit da­ha alınır. Materyalin total kalınlığı 4 mikron olduğundan, hücre kesitlerin hepsinde de vardır. Birinci kesit, pozitif hormon tayini oluşturan immunositokimyasal reaksiyonlar için kullanılır; aradaki ince kesitler nörosekretuvar granül görünümünü tayininde, en son kesit ise (yarı-ince) immünolojik kontrol kesidi olarak kullanılır. Bu teknik, polipeptit hormonun antijenik kompenenti fiksasyon veya gömme esnasında denature olmadı ise bir de­ğere sahiptir.

Histokimyasal Teknikler: Bu teknikler en iyi yarı- spesifik tekniklerdir. Çalışmalar birkaç tekniği aynı anda uygulayarak ve sonuçlarını karşılaştırarak yapılmalıdır. Özellikle de farklı argirofil yöntemler uygulanmalıdır. Çünkü bazı polipeptid hormonlar, özel bir fiksatiften sonra bir gümüş tekniği ile boyanırken, başka bir teknikle boyanmayabilir.

İmmünositokimyasal Yöntemler: İmmunositokimyasal teknikler kullanarak polipeptit hormonların gösterimi ile kesin tayin yapılır. Aşağıdaki kriterler mutlaka yerine getirilmelidir.

1-Saflaştırılmış doğal veya sentetik antijen, hangi antibodiye karşı kullanılacaksa hazır olmalıdır. Günümüzde birçok barsak hormonu için uygun antijenik materyal vardır.

2-İncelenecek doku, araştırılan polipeptid hormonun antijenik kompenenti değişmeden kalacak şekilde muhafaza edilmelidir.

3-Diğer polipeptit hormonlarla yapısal olarak ilgili olan çapraz reaksiyonlar olmamalıdır. Tüm gerekli kontroller yapılmalıdır.

4-Ortaya çıkan herhangibir antijen-antikor reaksiyonu hemen görülmelidir.

Eğer saf spesifik antibodiler varsa birinci problem fiksatifin seçimidir. Gastrin, insulin ve pankreatik glukagon için aldehit fiksasyonu uygundur ve parafine gömülmüş materyelde gösterilebilir. Dokunun freeze drying’ inden sonra 55 derecede sir vapour faz fiksatif olarak cros-linking ajanı olan dietil pirokarbonat kullanarak sekretin, enteroglukagon, gastrik inhibitör polipeptid (GIP), APUD sistemde belirlenen yeni bir hormonun, antijenik determinantlarının fiksasyona duyarlılık yeteneği saptanmalı, uygun fiksasyon kullanılmalı ve antijen-antibodi komp­leksi için floresans mı yoksa peroksidaz tekniği mi kullanılacağına karar verilmelidir.

İmmunofloresans Yöntemler: Antijen gösterimi için kullanılan teknikler bir ya da iki basamaklı olabilir. Bir basamaklı (direkt) tekniklerde antikor genellikle fluorescein isothiocyanan uygun bir fluorokrom ile konjuge olur. İki basamaklı tekniklerde işaretlenmemiş antikorun (ör­neğin rabbit anti human gastrin) önce kriostatla alınmış kesitteki antijenle reaksi­yona sokulur; daha sonra spesifik antikorun (örnek goat anti-rabbit IgG) ortaya çık­tığı hayvanın serum IgG sine karşı işaretlenmiş bir antikor uygulanır. Üretilen her spesifik antiserum için antiserumların uygun derişimlerinin çalışılmasına gereksinim vardır.

İmmünoperoksidaz Yöntemler: Bir işaretleyici olarak fluorokromdandan ziyade peroksidazın kullanımı bazı avan­tajlara sahiptir. Öncelikle, ışık mikroskobik preperatlarda daha kalıcıdır ve alalade bir ışık mikroskobu ile incelenebilir ve zıt boya da yapılarak histolojik ayrıntılar da aynı zamanda aynı kesitde değerlendirebilir. İkinci olarak, teknik aynı zamanda immunoelektron sitokimya da uygulanabilir, halbuki floresans teknikler bu tekniğe uygu­lanamaz.

Özetle, fiksatifle indüklenmiş floresans kullanarak spesifik olarak biyolojik aminleri göstermek mümkündür. Uygun bir histokimya, normal fiksasyon ve gömme şartları altın­da 5-HT’ yi varlığını belirleyen amin-aldehit indirgeyici kompleksi gösterir. Salgı granülleri içindeki polipeptid hormonları gösteren çok çeşitli histokimyasal görüntülüme tekniği mevcuttur. Kombine olarak kullanıldıklarında ve özellikle de birkaç farklı argirofil teknik kullanıldığında kısmen yarı-spesifik olurlar. Ultrastrüktürel teknikler tek başına, granül boyutu, şekli ve densitesi hakkında bilgi sağlarlar fakat bu hormonlar için kesin sonuç veren teknikler, uygun olarak korunan dokuya spesifik antikorları immünofloresans veya immünoperoksidaz yöntemleri ile uygulamaya dayanmaktadır.
APOPTOTİK HÜCRELERİN İMMÜNOFLORESANS GÖSTERİMİ
TUNNEL YÖNTEMİ

Roche Marka Apoptotik Kit

1.Deparafinizasyon ve rehidrasyon standart prosedürle uygulanır (Kesitler 60 derecede 1 gece bekletilir. Ksilolde 1 saat, absolü ve azalan konsatrasyonlarda alkol (%100, 96, 90, 80, 70 ve bi distile su serileri) den geçirilip PBS de yıkanır.

2. Kesitler 15-30 dakika (30 dakika) 21-37 C de Proteinaz K ile inkübe edilir.

3. Kesitler 2 kez PBS de yıkanır.

4. Pozitif kontroller DNazI de 10 dakika 15-25 C de inkübe edilir.

5. Negatifler Label ile 37 C de 60 dakika inkübe edilirken (etüvde), pozitif kontroller TUNEL reaksiyon karışımı ile 37 C de 60 dakika inkübe edilir.

6. Kesitler 3 kez PBS de yıkanır.

7. Örneğin (negatif ve pozitif) çevresindeki alan kurulanır. 50 μl converter POD kesitlerin üzerine konur. 37 C de 30 dakika etüvde inkübe edilir.

8. PBS de 3 kez yıkanır.

9. 50 μl DAB substratı kesitlere konur. 15-25 C de 10 dakika inkübe edilir.

10. PBS de 3 kez yıkanır.

11. Kapatılır ve incelenir.

TUNEL REAKSİYON KARIŞIMININ HAZIRLANMASI

Vial 1 (Enzim çözeltisi) ve Vial 2 (Label çözeltisi) 10 örneği boyamak için yeterlidir.

TUNEL REAKSİYON karışımı kullanmadan hemen önce hazırlanmalıdır. Karışım kullanılana kadar buz üzerinde kalmalıdır.

1. Vial (2) (Menekşe) den 100 μl alınır. Bu 2 negatif kontrol için kullanılan label çözeltisidir.

2. Vial (1) (Mavi) 50 μl enzim çözeltisi 450 μl kalan label çözeltisi (Vial 2) üzerine eklenir. Toplam 500 μl TUNEL REAKSİYON karışımı hazırlanmış olur. Karışım iyice karıştırılır.

Tunnel reaksiyon karışımı kullanılana kadar buz üzerinde tutulur.
BAZI ÖZEL PREPARATLARIN HAZIRLANMASI

1-KAN PREPARATI: Canlı ve cansız olarak kan hücreleri incelenebilir.

a-Canlı inceleme: Doğrudan doğruya parmaktan lama alınan kan incelenir veya % 0.9’luk fizyolojik sıvı içersine kan damlatılıp incelenir. Eritrositler birbirinden ayrıldığı için iyi izlenir.

Ayrıca 300 mg nötral red 100 cc distile suda eritilir. Bir damla nötral red lam üzerine konur ve yayma yapılır ve kurutulur. Sonra bir damla kan konur ve lamel kapatılır. Bir süre sonra kan hücrelerinin bu boyayı aldıkları görülür. Eritrositler bu boyayı almaz. Sıcak kanlı hayvanlarda lökositlerin ameboid hareketini görmek için lam hafifçe ısıtılır. Soğuk kanlı hayvanlarda oda sıcaklığında bu hareketler görülebilir.

b-Cansız inceleme: Parmaktan lama alınan kan, diğer bir lam ile ince şekilde yayılır. Hafifçe kurutulur. Metil alkolde 3 dakika bekletilir. Daha sonra lam üzerine distile su damlatılır. Biraz bekletilir, suyu akıtıldıktan sonra bir kap içindeki Giemsa boyasına konur (10 cc distile su+1 cc Giemsa). 30 dakika bekletildikten sonra çeşme suyunda yıkanır, kurutulur, incelenir.

2-MİTOZ HÜCRE BÖLÜNMESİ PREPARATI:

1-Küçük kıska soğanları kökleri su içine daldırılır.

2 Üç hacim absolü alkol+1 hacim glasiyal asetik asit içine uzamış kökler kesilerek konur ve biriktirilir.

3-Bu karışımdan alınan kökler 3 N HCl (24 cc HCl+100 cc’ye distile su ile tamamlanır) içinde 2-3 dakika bırakılır.

4-100 cc % 50’lik asetik asit içine 1 gram orcein konur. Asitten çıkarılan kökler boya içinde 1.5 saat bekletilir.

5-Lam üzerine bir kök alınır. Üzerine 1 damla % 45’lik asetik asit damlatılır.

6-Üzerine lamel kapatılır. Gazlı bez yardımıyla üstten hafifçe bastırılarak yayılır ve mikroskopta incelenir.

3-MAYOZ HÜCRE BÖLÜNMESİ PREPARATI:

1-Çekirge testisleri çıkarılır.

2-Üç hacim absolü alkol+1 hacim glasiyal asetik asit içinde 24 saat buzdolabında tespit edilir.

3-Saklamak için % 70’lik alkol kullanılır.

4-100 cc % 50’lik asetik asit içine 1 gram orcein konur. Boya içinde 30 dakika boyanır.

5-Dokudan alınan parça üzerine 1 damla % 45’lik asetik asit damlatılır. Ezilir.

6-Üzerine lamel kapatılır. Gazlı bez yardımıyla üstten hafifçe bastırılarak yayılır ve mikroskopta incelenir.

4-DÜZ KAS PREPARATI (Kurbağa Mesanesinden):

1-Bouin Çözeltisi: 9 gram pikrik asit 75 cc distile suda çözünür. 25 cc formaldehit ve 5 cc glasiyal asetik asit eklenir. Taze hazırlanıp kullanılmalıdır.

2-Kurbağa bayıltılır, mesanesi çıkarılır. Parafinde kaynatılmış ortası delik mantarın delik kısmı üstüne iğne ile gerilir.

3-Bouin çözeltisine aktarılır. Mesane alt yüzeyde olmalı ve Bouin ile temas etmelidir. 1-2 saat sonra mesane sarı renk alır ve sertleşir.

4-% 70’lik alkole atılır, rengi gidene kadar alkol değiştirilir.

5-Hematoksilen ile mor renk alana kadar boyanır.

6-% 70’lik alkolde hazırlanmış % 1’lik eozin ile 15 dakika boyanır.

7-% 70-90-100’lük alkollerde 10’ar dakika dehidre edilir.

8-Ksilolde 5 dakika tutulur.

9-Pensle mesane filtre kağıdı üzerine alınır ve küçük parçalara ayrılır.

10-Lama bir parça doku yerleştirilir ve entellan damlatılarak lamel kapatılır.
5-ÇİZGİLİ KAS PREPARATI (Çekirgeden):

1-Çekirgenin abdomeni açılır. 2 kas demeti görülür. Steromikroskop altında kas çıkarılır. % 0.6’lık sodyum klorürle hazırlanmış fizyolojik sıvıya konur.

2-Üç hacim % 95’lik etil alkol+1 hacim glasiyal asetik asit içinde tespit edilir.

3-Kaslar iğne yardımıyla didilir. 1 kas lifi lama alınır.

4-Üzerine 1-2 damla asetokarmin damlatatarak, 1-2 dakika beklenir.

5-Üzerine lamel kapatılır ve hafifçe bastırılır. Sonra lamelin bir tarafından filtre kağıdı ile boya çekilir, diğer taraftan % 96’lık alkol eklenir. Bu işlem 2 defa tekrarlanır.

6-Lameli yavaşça kaldırıp bir damla entellan damlatılır ve lamel kapatılır. Bu işlemlerin lamel kapatılarak yapılmasının nedeni kas üzerine baskı yapmaktır. Baskı olmadığı zaman kas büzülür.

6-KEMİK PREPARATI: Preparasyon 2 teknikle yapılabilir.

1-Yumuşatma tekniği : Gerekli maddeler varsa daha kolay ve uygun bir tekniktir.

2-İnceltme tekniği :Daha çok el becerisine dayanır.

a-Kemiğin yumuşatılarak preparat hazırlanması: Uzun kemik parçasının üzerindeki yağ ve kas kısımları bistüri ile temizlenir. Kemiği dekalsifiye etmek için % 5 veya % 7.5’luk nitrik asit (100 cc % 65’lik HNO₃ +1200 cc distile su) içine konur. 24-48 saat bırakılır. Sık sık çalkalanır. Beş saatte bir çözelti tazelenir. Kemikler jiletle kesilecek kadar yumuşayınca çıkarılır. 24-48 saat kadar % 5’lik sodyum sülfat içinde bırakılır. Asitin giderilmesi için çeşme suyunda 1-2 gün yıkanır. Keskin jiletle çok ince kesitler alınarak % 50 ve % 70’lik alkol bırakılan petri kaplarında 10-60 dakika bırakılır. Kreozot (karanfil yağı) içine alınarak 15-20 dakika şeffaflandırılır. Temiz bir lam üzerine alınan kemik üzerine entellan damlatılarak lamel kapatılır. Kesitler yeterli incelikte ise Havers lamelleri ve kemik kanalları izlenebilir. Mikroskopta inceleme yapılırken diyafram kısılırsa daha iyi görüntü alınır.

b-Kemiğin inceltilmesi ile preparat hazırlanması: Uzun kemiklerden kemik testeresi ile enine parçalar kesilir. Bunlar elektrikli veya kolla dönen döner zımpara taşlarında mümkün olduğu kadar inceltilir. Bir tahta üzerine konarak ince dişli demir eğe ile inceltilmeye devam edilir. Bu arada incelen kemikten kopmalar olur. Kopan parçalar ponza taşında tekrar inceltilmeye devam edilir. Ponza taşı üzerinde düzgün bir yüzey elde edilir. Bu yüzey üzerine su damlatılır. Kesitler parmak ucu ile taş üzerine sürtülerek daha da inceltilir. Parmak ucunda tutulan kesitlerden parmak izleri görünüyor ise kemik parçaları yeteri kadar incelmiştir. İncelmiş kesitler 5-10 dakika kadar nitrik asitte bekletilir. Sonra distile suda birkaç değişim yapılarak iyice yıkanır. Filtre kağıdı ile süzülür. Dikdörtgen ve kare şeklinde kesilerek lama yerleştirip, entellan damlatılıp lamel kapatılır.
7-KIKIRDAK PREPARATIN HAZIRLANMASI: Kurbağanın ön ve arka ekstremitelerinin eklem yerlerindeki kıkırdaklar kullanılır. Aneztezi uygulandıktan sonra ekstrimitelerden biri eklem yerinden kesilir. Kasları kemikten ayrılır. Temizlenmiş kemik % 0.8’lik NaCl içine konur. Keskin bir jiletle uzun kemiklerin uçlarındaki mavimsi renkli kıkırdaktan ince kesitler alınıp fizyolojik suda lamel altında incelenir. Boyamak için kesit, 1-2 damla asetokarmin içinde 1-2 dakika bekletilir ve lamel kapatılır. Bu arada materyel tespit edildiği için hücreler büzülür. Çekirdekler kırmızı, sitoplazma pembe boyanır. Kapsül ve ara madde az boyanır veya hiç boyanmaz.

Preparatın devamlı olması için:

a-Boyanan kesit % 96’lık alkolde 5 dakika bırakılır. Daha sonra kreozot (karanfil yağı) içine aktarılır. 30 dakikada kesitler şeffaflanır.

b-Kıkırdak pikrik asit içermeyen herhangi bir fiksatif içinde tespit edilir. Sonra iyice yıkanır. Aşağıdaki boya ile boyanır.

% 70’ lik etil alkol 100 cc

HCl 0.1 cc

Toluidin mavi si 0.1 g

Boyadan sonra % 70’lik alkol içinde (0.001 HCl’li) hiç boyası çıkmayıncaya kadar bırakılır. % 70-80-90-100’lük alkollerde sudan kurtarılır. Kreozotta şeffaflandırılır. Lam üzerine alınır, bir damla entellan damlatılarak lamel kapatılır.
8-KURBAĞA DERİSİ PREPARATI:

1-Kurbağanın sırt derisi kesilerek delikli bir mantar üzerine gerilir. Bouinde 3-4 saat tespit edilir. İğneleri çıkartılarak ufak parçalara bölünür. Sarı rengi giderilinceye kadar % 70’lik alkolde yıkanır.

2-%80-% 90- % 100’lük etil alkolde birer saat bırakılır.

3-Ksilol+% 30’luk alkolde 15-30 dakika

4-Ksilolde 30 dakika

5-Ksilol+parafinde 30 dakika

6-Etüvde erimiş parafinde 24 saat

7-Parafine gömülür. 12 µm’lik kesitler alınır. Kesitler bir gün bekletilir.

8-Ksilolde 5-10 dakika

9-Alkol serilerinde (% 100-96-80-80) beşer dakika tutulur.

10-Hematoksilende 15 dakika boyama

11-Akarsuda yıkama

12-Eozinle boyama

13-% 96-100’ lük alkollerde 1-2 dakika

14-Ksilolde 2-3 dakika

15-Kapatma

9-DEV KROMOZOMLARIN PREPARATI: Bu teknikte absolü metil alkol sadece tespit ve lamel kapatma sırasında çözücü olarak kullanılır. Ringer çözeltisine alınan ganglion veya tükrük bezi temiz bir lam üzerine alınır. Üzerine 1 damla % 45’lik asetik asit eklenerek 3-4 dakika tespit edilir. Fazla tutulursa parçalanır. Lamel kapatılır. Fiksatifin fazlası emdirilir.

Kullanılan lam daha önceden albümin veya başka bir yapıştırıcı sürülmüş ve kurutulmuş olmalıdır. Lam ve lamel içinde alkol bulunan bir kaba aktarılarak 12 saat ya da daha fazla bekletilir. Lamel kendiliğinden düşmemişse ince bir iğne yardımıyla lamel alınır. Üzerine tükrük bezi yapışmış lam alkolde doyurulmuş amonyum ferik sülfat bulunan kaba aktarılır. 12 saat bekletildikten sonra biraz hematoksilen kristali boyaya aktarılır. Alkol banyosundan sonra 5-10 dakika alkolde doyurulmuş lityum karbonat çözeltisinde bekletilir. Kırmızı bir boyama yapılacaksa 1-3 saniye alkolik eozinde (100 cc % 90’lık alkol+0.5 g eozin) bekletilir. Entellan damlatılarak lamel kapatılır.

GENEL BİLGİLER

Melanin sentezleyen hücre ile MELANOFOR (yapılı pigmenti sitoplazmalarında taşıyan hücreler) hangi yöntemle ayırt edilir ?

Yanıt: DOPA reaksiyonu

tirozinaz

Tirozin ® DOPA (dihidroksifenil alanin)

Enzim ¯

Melanin (Tip II melanozom )

(artık tirozinaz aktivitesi yok)
Melanositte tirozinaz enzimi bulunduğundan DOPA'yı okside edip sitoplazma içinde melanin oluşturarak siyahlaşmasına yol açar.
Tiroid'in folliküler ve parafolliküler hücreleri hangi yöntemle ayırt edilir?

Gümüşleme ile parafolliküler hücre granülleri siyah

Eozin ile parafolliküler hücreler parlak eosinofilik (çok bol mitokondrileri var)

Tiroidteki kolloid, PAS +Anilin Blue

Deride Langerhans hücrelerinin gösterimi?

En iyi yöntem altın klorid impregnasyonu ile uzantıları ile birlikte

H+E ile koyu nukleus; soluk şeffaf sitoplazma

Desmozom yok

Melanosom yok

Tonofilament yok

Diğer hücrelerde var.

Birbeck granülleri (Langerhans granülleri)(vermiform granüller)=Çubuk şeklinde, membranla çevrili

Sinir Dokusu Gösterimi?

Metilen mavisi ile sinir hücrelerini supravital

Golgi gümüşleme ile perikaryon ve uzantılar

Nissl boyası ie perikaryon

Weigert ile yalnızca uzantılar
Genital Sistem Gösterimi ?

Sperm başındaki akrozom PAS+ ile

Reinkre kristali azocarmin ile
Mitokondri Gösterimi ?

Krom veya osmik asitli fiksatiflerle tespit edilmeli ve çözelti asidofilik olmalı.

Janus green B (supra-vital boyama ile)

Altmann'ın anilin asit fuksini

Heidenhein'in demirli H+E ile

Kristal viyolet

Mallory'nin fosfotungustik asit hemotoksilen
Lizozomların Gösterimi?

Asit fosfataz reaksiyonu

İmmunolabeling

Akridin orange vb.vital boyalarla boyanarak (floresans mikroskobunda. Akridin orange vital boyadır).

DNA ve Seks Kromatini Gösterimi ?

Feulgen reaksiyonu

Hoechst,

Propidium iodide

Floresan vital boya

Nukleus, DNA’daki fosfat grubları nedeni ile bazik boyalarla boyanır.

Feulgen, DNA'nın deoksiribozu için spesifik bir histokimyasal reaksiyondur.

Seks kromatini, Nukleolusa bağlı kromatin ve DNA Feulgen + dir

RNA Boyaları?

Metil green pyronin ile

Nukleolus boyaları ?

Bazik boyalarla ® nükleik asitleri nedeni ile Hemotoksilen

Bazı asit boyalarla proteinleri nedeni ile Acridin orange ile kırmızı floresans verir.
Kromozom Boyaları ?

Quenn acrin

Acridin orange

Giemsa

Orcein

Baryum hidroksit

Y kromozomu ?

Floresans mikroskopta , özel boyamalar ile floresans vermesi ile ayırt edilebilir.

Paratiroidte parathormon granülleri hangi histokimyasal yöntemle gösterilir?

Esas hücrelerdeki parathormon granülleri

Demirli hematoksilen

Gümüşleme

Krom alum hemotoksilen

Mezotel Gösterimi ?

Gümüşleme ile sınırları gösterilir.

Pituisit Gösterimi ?

Gümüşleme ile siyah

GAG (Asit mukopolisakkarit) Boyaları

PAS ile parlak kırmızı

Alsian mavisi

Toluidin mavisi

Maskar Boyası:

Kollajen ve elastik lif aynı anda seçici olarak gösterilir.

Mallory de asit anilin ile kollajen lif kırmızı renkte

Naphtol green B + Safranelin

¯ ¯

Kollajen yeşil kırmızı ®elastik lif

Kupffer hücresi ise sinusoid endotel hücresi nasıl ayırt edilir?
Kupffer Endotel

Nukleus soluk Nukleus koyu

Peroksidaz + Peroksidaz (-)

Vital boya + Vital boya (-)

Safra kanalikülleri gösterimi ?

Gümüşleme

Alkalen fosfataz (+)
LABORATUVARDA KULLANILAN BAZI ÇÖZELTİLER

A-Cam kapları Yıkamak: Cam eşyadaki kaba kir, sabun, deterjan ve sıcak su ile temizlenir. Distile su ile çalkalanır ve kurutulur. Reçine ve parafin ile kirlenmiş camlar önce ksilen ile yıkandıktan sonra sıcak su ve sabunla yıkanmalıdır. Bu nedenle boyalarda kullanılan artık ksiloller saklanılmalıdır. Erimeyen organik kalıntılar, boya artıkları ve metalik tuzlar içeren cam kaplar aşağıdaki çözeltilerde birkaç dakika-gün bırakılarak temizlenir. Distile su ile çalkalanarak kurutulur.

1-Potasyum dikromat.......................200 g

Su.................................................1000 cc

Konsantre sülfürik asit...................750 cc

Önce potasyum dikromatı suda erit. Çözünmenin hızlanması için ısıtılabilir. Soğuğunca cam çubukla karıştırarak sülfürik asit yavaşca eklenir. Isı artar. Çözelti koyu yeşil oluncaya kadar kullanılabilir. Çözelti cam kapta hazırlanmalıdır.

2-Potasyum bikromat..................60 gr

Sülfürik asit..............................1000 cc

Çözelti cam kapta hazırlanmalıdır.
3-Potasyum permanganat.............10 gr

Sodyum hidroksit.......................10 gr

Distile su....................................100 cc

Pek kullanışlı değildir.

4-Kral Suyu

Hidroklorik asit..........................3 birim

Nitrik asit...................................1 birim

Çözelti cam kapta hazırlanmalıdır.

B-Lam ve Lamellerin Temizlenmesi: Yeni lam ve lameller % 90-95’lik alkolde bırakılır. Ardından tek tek gazlı bez ile kurulanır. Temizliğini kontrol etmek için pipetle üzerine su damlatılır. Su dağılırsa temizlenmiştir, damla halinde kalırsa halen kirlidir. Bunlar için yarı yarıya eter ve absolu alkol karışımında tutulur. Eğer reçineli ise sıcak su ve yıkama tozları ile iyice yıkanır, distile suda çalkalanır, % 90-95’lik alkolde bırakılır. Kurulanır. Lam ve lameller, bu yöntemle de temizlenmezse 1-2 gün temizleme sıvısında bırakılır, su ile yıkanır. Ardından amonyum hidroksitle alkalize edilmiş suda birkaç saat bırakılır. Suda yıkanır, alkolde bekletildikten sonra kurulanır.

Lamları Jelatinleme Yöntemi

Gelatine powder 5 gr

Kalium chrom (III) sülfat tuzu

(potasyum krom III sulfat) 0.5 gr

Distile su 500 cc
Lamları Yumurta Akı ile Yapıştırma Yöntemi

100 cc’lik mezüre yumurta akı doldurulur. 1-2 tane timol kristali konur. Baget yardımıyla timol ve yumurta akı iyice karıştırılır. Lama bir damla yumurta akı damlatılır ve diğer bir lam yardımıyla çok ince yayılır. Kurutulur ve kesitler bu yumurta aklı lam üzerine alınır.

LABORATUVARDA KULLANILAN BAZI ÇÖZELTİLER

1-Nötral Red: Bir şişe distile suya rengi kırmızı oluncaya kadar bu boyadan karıştırılır. Çözeltinin saydam olması gerekir.

2-Asetik asitli metilen yeşili: 100 cc distile suya 2 gram sirke asidi ve bir miktarda metilen yeşilinden karıştırınız. Çözeltinin rengi mavimsi yeşil olmalıdır.

3-Asetokarmin boyası: 45 cc asetik asit 55 cc distile su ile karıştırılır. 5 gram carmin boyası eklenir. Dar boyunlu bir cam kap içinde baget yardımıyla hafifçe kaynatılır. Çözelti soğuyunca fitre kağıdı ile süzülür. Ağzı sıkıca kapanan şişelerde uzun zaman saklanabilir.

4-Ringer çözeltisi:

Distile su 1000 cc

NaCl 9 g

CaCl₂ 0.2 g

KCl 0.2 g

NaHCO₃ 0.1 g