Işik mikroskopik teknikler

Sonuçlar:

Osteoid........................pembe .

Kalsifiye kemik.............morumsu kahverengi

Çekirdekler...................mavi

Eritrositler........... .........genellikle boyanmadan kalır

2-Diğer Teknikler

Matrajt ve Hioco (1966) nın solochrome cyanin yöntemi osteoid dokunun turuncu-kırmızı, kalsifiye kemiğin ise parlak mavi boyandığı bir yöntemdir. Masson' un trikrom boyası, dekalsifiye edilmemiş plastiğe gömülmüş kemik kesitleri ile ilginç sonuçlar vermektedir. Osteoid doku parlak kırmızı ve uygulanan fibril boyasına göre mavi veya yeşil kemik matriksi boyanmaktadır. Dekalsifiye edilmiş kemiğin parafin kesitlerinden genellikle elde edilen boyama sonuçlarının tersidir. Bunun nedeni ise bilinmemektedir. Bağ dokusu boyaları, kemik ve olgun kemiğin kollajen matriksini çift kırıcı yaptığından yararlıdır aynı zamanda çift kırıcılık polarize ışık ile boyanmamış kesitlerde de güzel görünebilmektedir. Selüloz nitrat ve frozen kesitler, Van Gieson'un pikro-fuksin boyası kemiği parlak kırmızı boyarken, Masson trikrom boyası uygulanan fibril boyasına bağlı olarak mavi veya yeşil boyamaktadır. Parafin kesitlerde Masson ve benzer yöntemler daha az değerlidir. Kemik matriks boyanması ya plazma boyası ile ya da fibril boyası ile veya her ­ikisinin karışımı ile değişkendir. Pratikte Van Gieson boyası daha ya­rarlıdır ve sıklıkla parlak kırmızı boyanan osteoid ve trabeküler ve olgun kemiğin sarımsı-pembe boyanması ile kolaylıkla ayırtetmek mümkündür. Retiküler fibriller için gümüş çöktürme yöntemleri, modifikasyonsuz kemik kesitlerine uygulanabilir. Sement çizgilerine gümüş çökmez ve tonlanmamış preperatlardaki kemik matriksinin kahverenkli boyasına karşı negatif olarak görülmektedir. PAS Yönteminin kemik patolojisinde önemi vardır; süngerimsi kemik daima kuvvetli pozitif iken osteoid ve lamellar kemik negatiftir. Kemik laküna ve kanalikülleri Schmorl yöntemi ile gösterilebilir. En iyi sonuçlar selüloz nitrat veya frozen kesitlerle elde edilir. Bu­nun da nedeni yöntemin prensibinin bazik boyanın (thionin) pikrik asit­le dar kanallara ve boşluklara çökmesi olabilir. Bu kesitler daha az büzülür ve parafin kesitlerden daha fazla granülün çökmesine izin verir.

Schmorl Yöntemi

Tespit: Kritik değildir. % 10'luk formal-salin elverişlidir.

Kesitler:Selüloz nitrat veya frozen kesitler

Teknik:

Selüloz nitrat veya frozen kesitler 10 dakika birçok değişim yapılarak distile suda yıkanır.

5-10 dakika thionin’ in yarı-doymuş sulu solüsyonu ile( % 0.125) boyanır.

Distile suda yıkanır.

Suda doyurulmuş pikrik asitte 30-60 saniye bırakılır.

Distile suda yıkanır.

% 70' lik alkolde boya kesitten akana kadar ( 5-6 dak.) differensiye edilir.

Distile suda çalkalanır.

Doymuş pikrik asitte 30-60 saniye bırakılır.

Distile suda çalkalanır.

% 95' lik alkolde dehidre edilir.

Lama monte edilerek, % 95' lik alkol-terpineol karışımı ile şeffaflandırılır..

Euparal ile kapatılır.

Sonuçlar:

Laküna ve kanaliküller koyu kahverengiden siyaha

Kemik matriksi sarı veya sarımsı kahverengi

Çekirdekler kırmızı

Kıkırdak menekşemsi

Açıklamalar: Tionin örnekleri bu metoda uyabilirliğinde önemli olarak değişebilir. Eğer bir test kesiti iyi boyanmazsa, her 25 cc^' lik boyaya 1 damla kuvvetli amonyak ekleyip filtre edip hemen kullanınız. Pikrik asitle ikinci uygulama orijinal yönteme bir ilavedir. Alkol ve sudan geçirilirken bazen kaybolan kemik matriksinin renklenmesini sağlamaya yaramaktadır. % 70' lik alkolde bir zaman saklanan selüloz nitrat kesit­ler tatminkar olarak olmayabilirler. Nedeni bilinmemektedir; aynı materyelden taze kesitler güzel boyanmaktadır. Thioninden başka boyalar bu yöntemde kullanılabilir. Azur A iyi sonuçlar vermektedir.

KEMİK İLİĞİ KESİTLERİNİN BOYANMASI: Boyanmış kemik iliği kesitleri, boyanmış smearlerle birlikte ideal olarak incelenirler. Hücresel ayrıntı, Romanovsky yöntemi ile boyanmış smearlerde çalışılmalıdır. Kesitler hücresellikte ve yapıda değişiklik­ler göstermektedir ve iyi differensiye olmuş H-E boyaması yorumlanmala­rı için yeterlidir.

Leishman Boyası

İnce parafin kesitler suya indirilir. pH 6.8 de tamponlanmış su­da 30 dakika bırakılır.

Bir hacim Leishman boyası, 2 hacim tamponlanmış pH 6.8 su karışı­mında 10-15 dakika bırakılır.

pH 5' de tamponlanmış su ile hazırlanmış % 50' lik metil alkol ile yıkayıp differansiye edilir.

Kesitte çekirdekler mor ve polimorfların granülleri belirgin olarak görüldüğünde tamemen kuruyana kadar beklenir. Ksilende şeffaflandırılır ve yeşil Euparal ile kapatılır.

Sonuçlar:

Nükleuslar menekşe

Lökosit granülleri kırmızıdan (eozinofil) koyu menekşeye (bazofil) kadar

Kırmızı kan hücreleri pembe

Wolbach'ın Giemsa Boyası ( Lillie, 1965)

Tespit: Zenker veya Möller'in (Regaud) sıvıları diğer fiksatiflerden sonra kullanılabilir.

Kesitler: İnce parafin kesitler alınır.

Teknik:

Kesitleri distile suya indirin.

Giemsa ile 1 saat boyama

Giemsa boyası.....................1 cc

Metil alkol ........ …………….1.25 cc

% 0.5' lik sodyum karbonat.. …2 damla

Distile su ……………………….40 cc

Boyayı dökün ve tekrar aynı karışımda 1 saat bırakın ardından ise 1 gece bırakın.

Birkaç damla % 10' luk colophonium alkol içeren % 95'lik alkolde differensiye edin.

% 100' lük alkolde dehidre edip, ksilende şeffaflandırın ve sedir yağı ile kapatın.

Sonuçlar:

Çekirdekler.. ........ ……………………………..koyu maviden menekşeye kadar

Eritrositler.............................................. …….sarıdan pembeye kadar

Hemapoietik hücrelerin sitoplazmaları ....... .granülleri açık mavi boyanır.

Bayley'in Asit Giemsa Yöntemi (Bayley 1949)

Asetik formalinde tespit edilmiş ve nitrik asitte dekalsifiye edil­miş dokulara uygulanmaktadır. Tatmin edici sonuçlar diğer fiksatiflerle de elde edilebilmektedir ve dalak gibi dokularda dekalsifikasyona gerek yoktur.

Teknik:

Kesitler distile suya indirilir.

Erlich hematoksileni ile boyanır.

Bilinenden daha fazla differensiye edilir.

Çeşme suyunda mavileştirilir.

Distile suda çalkalanır.

10 dakika aşağıdaki çözelti ile boyanır.
Giemsa stok çözeltisi . ......... 15 hacim

% 1^' lik asetik asit............ ........10 hacim

Distile suda çalkalanır ve kurutma kağıdı ile kurutulur. Differensiye edilip absolü alkolde dehidrasyonu tamamlanır. Ksilende şeffaflandırılarak kapatılır.

Sonuçlar:

Kemik trabekülleri..............................................................pembe

Kıkırdak ara maddesi.........................................................menekşe

Eozinofil ve bazofil myelositlerin granülleri çok iyi gö­rülmektedir.

Kırmızı kan hücreleri..........................................................pembe

Çekirdekler........................................................................mavi

Açıklamalar

Zıt boyama asetik asit oranı ile kontrol edilebilir, daha fazla asetik asit kuvvetli eozin boyanmasını sağlar. Son dehidratasyon hızı mavi boyayı kontrol etmektedir. Yöntem, celloidin kaplama ile de iyi sonuç vermektedir. Herhangibir Romanowsky-tipi bir boya Giemsa yerine kullanılabilir fakat Giemsa daha az precipitasyon oluş­turur.

WRIGHT BOYASI (KAN HÜCRELERİ İÇİN )

1 gr toz Wright boyası

1 cc gliserin

395 cc Metil alkol

Toz boya, eğer partiküllü ise havanda dövülerek ezilir. Daha sonra 1cc gliserin ilave edilerek iyice karıştırılır. 395 cc metil alkol yavaş yavaş ilave edilerek karıştırılır. 1-2 saat rotatorda döndürülerek iyice karışması sağlanır.

Uygulama: Steril şartlarda parmak ucu veya kulak memesinden alınan kandan 1 damla yayma yapılır. Oda ısısında kurutulur. Damlalık kullanarak, lamın üzerini kaplayacak şekilde üzerine Wright boyası damlatılır. Bir dakika boyadıktan sonra yine damlalıkla, yaklaşık lamdaki boya kadar distile su ilave edilir. 2 dakika bekledikten sonra çeşme suyunda yıkanır. Kurutma kağıdına dik bir şekilde koyarak kuruması sağlanır. Kuruduktan sonra uygun bir alan seçilerek 1 damla immersiyon yağı damlatılıp mikroskopta incelenir.
DİFFÜZ NEUROENDOKRİN SİSTEM (DNES) HÜCRELERİNİN GÖRÜNTÜLEME TEKNİKLERİ .

Hücreden hücreye çok belirgin farklılıklar göstermeyen DNES hücre granüllerini saptamak zordur. Tek tek dağılan DNES hücreleri yarı spesifik histokimyasal teknikler kullanılarak araştırılabilir. Bu yöntemler sadece granül içermiyen hücrelerden, granül içeren hücreleri ayırt etmek için kullanılmaktadır. Endokrin hücre granülleri kurşun hematoksilen ile boyanabilmektedir. DNES hücre granüllerinin görünümü ve içeriklerine bakarak tanımlama yapılmak istenirse ultrastrüktürel, immunofloresans ve immunoenzim çalışmaları yapılmalıdır. DNES hücre granüllerini incelemek için uygun bir doku hazır­lama yönteminin seçimi de çok önemlidir.

ULTRASTRÜKTÜREL YÖNTEMLER: E.m. için rutin prosedürden geçirilmiş ve boyanmış materyel kullanarak intraselüler nörosekretuvar granüllerin varlığı veya yokluğu saptanabilir. Granüllerin büyüklüğü, şekil ve densitesi hakkında veya granüllerde halonun bulunup bulunmadığı hakkında bazı bilgiler elde edilebilir.

HİSTOKİMYASAL TEKNİKLER: Aldehit fiksasyonu yapılmış ve parafine gömülmüş materyellerin tamamına en uygun histokimyasal görüntüleme yöntemi, bazik ve metakromatik boyaların, kurşunlu hematoksilen ve argirofil yöntemlerinden birinin kullanıl­masıdır. Bu yöntemlerden birden fazlası aynı doku üzerine uygulanmalıdır.

a-Bazik ve Metakromatik Boyalar: Metakromatik fluorokromlan içeren bazik ve metakromatik boyalar, polipeptidlerin anyonik karboksil, sülfat ve fosfat grupları ile reaksiyona giren katyonik boyalardır. Bu boyalar aminoasit sıralaması hakkında bilgi vermezler ve spesifik olarak hormonları gösteremezler. Pratikte, metakromatik boyalarla kısmen daha fazla bilgi edinilir. Metakromatik boyaların sekonder protein yapısını gösterdiğine inanılır. Reaksiyon, nükleotidlerde nor­mal olarak bulunan reaktif grupların asit ile hidrolize edilerek uzaklaştırılması ile geliştirilebilir ve aynı zamanda yan zincir karboksillerini de meydana çıkarır.

Asit İle Hidrolizden Sonra Bazik ve Metakromatik Boyalar

Fiksasyon: Formalin, paraformaldehit, gluteraldehit, Bouin, Helly

Kesitler: Parafin

Azure A çözeltisi: % 0.005'lik distile suda hazırlanmış azure A

Toluidin Blue çözeltisi: 20 mM Mc İvaine tamponu ile pH 5'e tamponlanmış distile sudaki % 0.01 lik Toluidin Blue

Alcian blue çözeltisi:Asetat tamponu ile pH'sı 5 ' e ayarlanmış % 0.1'lik alsian blue

Hidroliz için asit çözeltisi: 0.2 M'lık HCl

Yöntem

1-Kesitleri suya indir

2-Asit hidroliz çözeltisinden (0.2 M) geçirme:

60-65 C’ de 3-4 saat (formalin, paraformaldehit, Bouin ile fikse edilenler)

60-65 C’ de 12 saat (gluteraldehit veya Helly ile tespit edilenler)

3-Suda iyice yıka

4-Aşağıdakilerden biri ile boyayınız.

a- Azure A çözeltisi ile 6 saat

b-Toluidin blue çözeltisi ile 6 saat

c-Alsian blue ile 10 dakika

5-Ya suda çalkalayıp gliserin jelly ile kapatınız ya da kurutma kağıdı ile kurula­dıktan sonra 1 dakika saf isopropanol ile iyice ıslatın, ksilolde şeffaflandırın ve DPX'le kapatın.

DNES granülleri toluidin blue ve azure A ile menekşe-kırmızı alsian blue ile mavi

AÇIKLAMALAR: Azure A ve toluidin blue yöntemlerinde artan dereceli alkol serilerinde dehidrasyon yapılmaz. Alsian blue yöntemi ile musin granülleri (örnek ince barsak mukozasındakiler) boya­nacaktır ve DNES granülleri ile karıştırılmamalıdır.

b-Kurşun Hematoksileni

Kurşun hematoksilen tekniği, endokrin hücrelerin boyanması için adapte edil­miştir. Kurşun hematoksileni, karboksil ve karboksi-amid grupları ile birleşerek bir bazik boya gibi hareket eder. Bağlanmanın sadece heteropolar olmadığı fakat kısmen kurşunun kendinden dolayı olduğuna dair bazı bulgular vardır. Asit ile hidrolize edildikten sonra kullanılırsa daha kuvvetli boyar fakat genellikle hidro­lize edilmeden kullanılmaktadır.

Fiksasyon: Tercihen formaldehit veya gluteraldehit

Kesitler : Parafin

Stabilize kurşun çözeltisi:

%5' lik su ile hazırlanan kurşun nitrat...... ...50 cc

Suda doyurulmuş ammonium asetat...........50 cc

Filtre edilir ve % 40' lık formaldehitten 2 cc eklenir.

Kurşun hematoksileni boyama çözeltisi

Stabilize kurşun çözeltisi ...........10 cc

% 95' lik etil alkol....................... 1.4 cc

Hematoksilen..............................0.2 g

Distile su.....................................10 cc

Yukardaki sıra ile karıştırıp, çalkalayın. 30 dakika sonra filtre edin ve filtratı 75 cc ye distile su ekleyerek tamamlayın.

Uygulama

Ksilolle parafini uzaklaştırın, artan alkol serilerinden geçirerek suya indirin.

37 C’ de 2-3 saat veya 45 C ' de 1-2 saat kurşun hematoksilen boyama çözeltisi ile boyayın.

Distile suda yıkayın, sudan kurtarın, şeffaflandırın ve kapatın.

Sonuçlar:

Endokrin ve DNES hücre granülleri................ koyu mavi-siyah

Kas ve sinirler gibi diğer yapılar ..................... siyah

Açıklamalar:

1-Doku gluteraldehit ya da Helly ile tespit edilmişse boyama süresi uzatılmalıdır.

2-Stabilize kurşun çözeltisi birkaç hafta dayanıklıdır, fakat çözelti taze olarak kullanılırsa daha iyi sonuçlar elde edilmektedir.

3-Kesitler suya indirildikten sonra 0.2 M¹ lık HCL çözeltisinden geçirerek hidrolize edilirse daha iyi boyama sonuçları alınmaktadır.

60-65 C’ de 3-4 saat: formalin, paraformaldehit ve Bouin ile tespit edilenler

60-65 C¹ de 12 saat: gluteraldehit veya Helly ile tespit edilenler

ARGİROFİL GÜMÜŞ TEKNİKLERİ

Tüm gümüş boyama tekniklerinde kullanılan gümüş tuzu önce doku kompenentlerine tutunur ve sonradan bağ hücrenin kendinde var olan bir indirgeyici madde ile (argentaffin teknik) ya da dışardan eklenen bir indirgeyici ajanın ( hidrokinon veya formalin) (argirofil tekniği) indirgenmelidir. Argirofil teknikler yarı-spesifik tekniklerdir. Görüntüleme amacı için önemli bir değeri vardır. Uygulanan fiksatifdeki ve gümüş tuzundaki farklılıklar, farklı sonuçlar doğurur ve herhangibir karşılaştırmanın geçerli olması için fiksasyon ve gümüş tuzu standardize edilmelidir. Formalde­hit fiksasyonundan sonra Grimelius'un (1968) tekniğini tercih edilebilir. Grimelius yöntemi ile negatif olan DNES hücreleri başka tekniklerle göste­rebilir.

Argirofil Hücreler İçin Grimelius Gümüş Yöntemi ( Grimelius, 1968)

(Pankreasın A Hücreleri)

Fiksasyon:Bouin veya formaldehit. Eğer Bouin uygulanacaksa bazı yazarlar 2. fiksasyonu da önermektedir.

Kesitler: Parafin

Gümüş çözeltisi

Asetat tamponu (pH=5.6).....................1O cc

Çift distile su ........................................87 cc

Taze hazırlanmış % l' lik gümüş nitrat ( su ile) ....3 cc

İndirgeyici çözelti

Hidrokinon........................................1 g

Sodyum sülfit (kristal).......................5 g

Distile su...............................100 cc

Bu çözelti taze hazırlanmalıdır.

Uygulama

1-Kesitler suya indirilir,

2-60⁰ C’de 3 saat gümüş çözeltisine kesitler konur

3-Kesitlerdeki gümüş çözeltisinin suyu kurulanır.

4-Taze hazırlanmış indirgeyici çözeltisine 45⁰ C^’ de 1 dakika daldırın

5-Kesitler distile suda çalkalanır.

6-Gerekli ise zıt boyama yapılır.

7-Çeşme suyunda yıkanır.

8-Dereceli alkollerle dehidre edilir.

9-Ksilolde şeffaflandırıp, DPX veya Kanada balzamı ile kapatılır.

Sonuçlar:

Argirofil A adacık hücresi pozitif (kahverengi-siyah)

B ve D hücreleri negatif

Birçok diğer argirofil hücreler pozitif (kahverengi-siyah)

Açıklamalar

1-Eğer zayıf bir pozitif reaksiyon alınmışsa, sonuçlar ikinci kez gümüşleme yapılarak geliştirebilir. İndirgeyici çözeltisinden sonra, kesitler 2 dakika % 5’ lik sodyum tiyosulfat ile muamele edilir, distile suda çalkalanır ve oda ısısında taze hazırlanmış gümüş çözeltisinde 10 dakika bırakılır. Bunu 45^0'C de 1 dakika taze hazırlanmış indir­geyici çözeltisinde bırakma takip etmelidir.

2-Zıt boyamalar normalde kullanılmamaktadır.

ARGİROFİL HÜCRELER İÇİN ALKOLİK GÜMÜŞ NİTRAT YÖNTEMİ

(Pankreasın D Hücreleri İçin )

Fiksasyon: Bouin veya formaldehitten sonra Bouin ile 37 C de 2 saat post-fiksasyon

Kesitler: Parafin

a.Gümüş çözeltisi

Gümüş nitrat 10 gr

Distile su 10 cc

% 95' lik alkol 90 cc

Konsantre amonyum hidroksit ile pH¹ sı 5 ‘ e ayarlanır.

b.Geliştirici çözelti:

Pyrogallic asit 5 gr

% 95’lik alkol 95 cc

% 40' lık formaldehit 5 cc

1.Çeşme suyuna indirilen kesitler, çeşme suyunda 1 saat yıkanır

2.% 95' lik alkol ile dehidre edilir.

3.Bir gece 37 ⁰C de gümüş çözeltisinde bekletilince ışık almamasına dikkat edilir

4.% 95' lik alkolde hızla çalkalanır ( 10 saniyeyi geçmemelidir)

5.Kesitleri 1 dakika geliştirici çözelti ile muamele ediniz

6.3 defa % 95' lik etil alkolde birer dakika çalkalayınız

7.Absolu alkolde 1 dakika çalkalayınız

8.DPX ile kapatınız.

Sonuçlar

Pankreasın D hücresi granülleri..............................pozitif (kahverengi-siyah)

A ve B hücreleri.......................................................negatif

Diğer argirofil hücreler.............................................pozitif

ARJENTAFFİN GRANÜLLER İÇİN MASSON-FONTANA YÖNTEMi

Fenolik bileşiklerin gümüş çözeltilerinin metalik gümüşe indirgeme kapasiteleri vardır. Direkt indirgeme (arjentaffin reaksiyon) sadece alkolsiz fiksasyondan sonra ortaya çıkabilir. Ek bir indirgeyici maddenin kullanıldığı herhangibir gümüş çöktür­me tekniği arjentaffin ve argirofil hücreleri siyahlaştıracaktır.

Fiksasyon: Formal-salin veya formalin içeren fiksatifler. Alkol veya alkollü fiksatifler kullanılmamalıdır.

Kesitler: Parafin

Fontana Çözeltisi

% 10' luk gümüş nitrat 20 cc

Konsantre amonyak

Distile su 20cc

Gümüş nitrat üzerine damla damla konsantrik amonyak sadece çözeltide hafif bir çökelti kalana kadar damlatılır. 20 cc distile su eklenir. Çözelti taze olarak kul­lanılmalıdır, fakat kahverengi şişede birkaç gün dayanabilir.

Hexamine gümüş çözeltisi

Stok çözelti: % 5' lik 5 cc gümüş nitrat çözeltisi, % 3’1ik 100 cc hexamine çözeltisi eklenir. Beyaz renkli tortu kaybolana kadar çalkalayın. Kullanım için, 100 cc hexamin gümüş çözeltisine pH=7.8 olan 25 cc borik asit-borate tamponunu ekleyin. Stok gümüş çözeltisi buzdolabında birkaç ay dayanır.

pH=7. 8 olan borik asit-borat tamponunun hazırlanışı

1/5 M borik asit : 12.4 gr borik asidi distile suda çözün ve 1 litreye tamamlayın.

1/20 M sodyum tetraborate (boraks):19.1 gramını distile suda çözün ve 1 litreye tamamlayın.

160 cc 1. çözelti + 40 cc 2. çözelti eklenerek tampon hazırlanır.

1.Parafin kesitleri suya indirin

2.10 dakika Gram’ ın iodine ile muamele edin

İodine kristali .......................... l gr

Potasyum iodide.......................2 gr

Distile su......................................300 cc

3. % 5' lik sodyum tiyofosfat’ ta............... 2 dakika

4-Birçok defa ayrı ayrı kapta distile su ile çalkalayın

5-İki gümüş çözeltisinin birinde, karanlıkta ve ağzı kapalı kavanozda 1 gece boyayın

6.Birçok kez ayrı ayrı kapta distile su ile çalkalayın

7.% 0.2’ lik altın klorid ile yaklaşık 2 dakika renklendirin

8-Distile suda çalkalayın

9-% 5’lik sodyum tiosülfat ile 2 dakika

10-Akarsuda çalkalama 2 dakika

11.%0.1’ lik safranin veya % 1’ lik nötral red ile 2 dakika boyama

12.Suda yıkama

13.% 70’ lik alkolde differensiye edilir.

14.Alkollerle dehidrasyon

15.Şeffaflandırma

16.Kapatma

SONUÇLAR

Melanin.............................. siyah

Arjentaffin granülleri.....gri-siyah (karsinoid tümörlerin granülleri kahverenkli olabilir)
Çekirdekler...................kırmızı

Açıklamalar

1-İodin sülfidril gruplarından dolayı ortaya çıkacak olan yanlış reaksiyonları önlemektedir. Civa ile tespit edilen dokulardan civanın uzaklaştırılmasını da sağlar. 2. ve 3. İşlem basamaklarını uygulamak zorunlu değildir.

2-Fontana çözeltisi siyah gümüş granüllerini kesit üzerine çöktürür. Heksamin gümüş çözeltisine göre non-spesifik siyah fon vermeye daha hassastır.

3-İntestinal epiteldeki arjentaffin hücre granüllerine ek olarak kromaffin granülleri ve lipofuksinler değişik yoğunluklarda pozitif gümüş reaksiyonları verebilir.

4-Gümüş çözeltileri patlayıcı olabilir, dikkat edilmelidir.

5-Altın kloridleme işlemi isteğe bağlıdır, uygulanmayabilir.

ARJENTAFFİN GRANÜLLER İÇİN GİBBS YÖNTEMİ

Bu yöntem, alkalin çözeltideki bir fenolün Gibbs reaktifi ile reaksiyona girdiğinde kahverengi veya indofenol boya oluşturması esasına dayanmaktadır. Yöntem iyi bir seçicilik ve renk kontrası vermektedir.

Fiksasyon: Formal – saline

Kesitler: Parafin

Boyama çözeltisi: 5-10 cc alkolde 50 mg 2:6– dichloroquinone-chloroimide’i çözün. 50 cc distile su ekleyin ve birkaç damla doyurulmuş boraks çözeltisi damlatın. Pearse (1972), aynı kontrasyondaki maddeyi pH= 9.2 olan 0.1 M’lık veronal asetat tamponunda 70 C’de çözülene kadar bekletilmesini, kullanılmadan önce soğutulup filtre edilmesi tavsiye etmektedir.

YÖNTEM

1.Kesitler suya indirilir.

2.Boyama çözeltisinde oda ısısında 10-15 dakika boyanır.

3.Akarsuda iyice yıkanır.

4.Çekirdekler % l’ lik nötral red ile zıt boyanır.

5.Alkollerde hızla dehidre edilir ve ksilolde şeffaflandırılır.

6.Kapatılır.

ARGİROFİL HÜCRELER İÇİN İNDİRGEYİCİ GÜMÜŞ YÖNTEMLERİ

Bir indirgeyici ajanın kullanıldığı gümüş yöntemleri (retikülin teknikleri, Bielschowsky yöntemi) argirofil ve arjentaffin hücreleri siyahlaştıracaktır. Hidrokinon redüksiyonu ile protargolun kullanıldığı Bodian (1936) yöntemi çok kullanılmaktadır ve pankreas adacıklarının argirofil hücreleri için kullanılan bazı teknikler (Grimelius 1968) APUD sistemin farklı argirofil hücrelerinin tanınması için geliştirilmiştir. Pascual (l976)'in çiftli gümüş impregnasyonu modifikasyonu, fonda impregrasyona yol açmadan argirofil hücrelere iyi bir kontrast veren basit bir yöntemdir. Fiksasyon formal-salinle yapılır. Parafine gömülür.

a.Bodian^’ in indirgeyici çözeltisi

Anhidros sodyum sülfit...........5 gr

Hidrokinon...............................1 gr

Distile su………………………..100 cc

b. Nuclear-fast red

Nuclear-fast red (Kernechtrot).......................0.1 gr

Aliminyum sülfat............................................5 gr

Distile su.........................................................100 cc

YÖNTEM

1-Kesitleri suya indirin

2-Distile su ile taze hazırlanmış % 0.5 gümüş nitrat çözeltisine ya 60 C’ de 2 saat veya oda ısısında bir gece kesitleri koyun

3-Distile suda çalkalayın

4-Önceden 60 dereceye kadar ısıtılan taze hazırlanmış Bodian'in indirgeyici çözeltisine kesitleri aktarın ve 5 dakika muamele edin

5- Üç dakika akarsuda yıkayın ve distile suda çalkalayın

6-Aynı gümüş çözeltisinde 60 C’ de 10 dakika tekrar çöktürme yapın

7-Distile suda çalkalayın

8-Dört ve beşinci işlem basamaklarını tekrarlayın

9-Nuclear-fast red ile 3 dakika boyayınız

10-Çeşme suyunda çalkalayın, dehidre, şeffaflandır ve kapat