Işik mikroskopik teknikler

Sonuçlar

Çekirdekler ........................kırmızı

Kas..................................... kırmızı

Bağ dokusu......................... mavi

SİNİR DOKUSUNU İNCELEME YÖNTEMLERİ

Sinir dokusu, protein sentezinin yoğun gerçekleştirildiği nöronları içerdiği için bazik boyalarla; uzantılı hücrelerden oluştukları için uzantıları gösterebilmek için ise metalik çöktürme yöntemleri ile (Bielchowsky, Cajal ve Golgi teknikleri) incelenirler. Ayrıca, immünositokimyasal, immünohistokimyasal ve immünofloresans teknikler de uygulanmaktadır.

A-MERKEZİ SİNİR SİSTEMİ:Metalik çöktürme yöntemleri nörohistolojide çok kullanılmaktadır. Rutin preperasyonda akson ve dendritlerin boyalarla gösterilmesi mümkün değildir. Formalin ile tespit edilmiş, H ve E ile boyanmış parafin kesitlerde az miktarda bazı hücre uzantıların ve fibrillerin gösterilmesi sağlanabilir. Özel fiksatiflere veya mordantlara ve frozen veya selüloz nitrat kesitlere sıklıkla gerek vardır. Otolizde beyin, böbrek gibi iyi farklanmış organlar, elastik ve kollajen fibrillere göre daha çok etkilenir. MSS' nin otolitik değişikliklere eğilimli olması ve hızlı fiksasyon arzu edilmesine rağmen, beyin fiksasyon tamamlandıktan sonra parçalara ayrılmalıdır. Beyin yüzeyinde bulunan tümörlerin küçük parçaları daha hızlı inceleme için alınabilir. Histokimya veya elektronmikroskopi gibi özel amaçlar için kullanılacak örnekler, fiksasyondan önce çıkarılmalıdır. Organ bütün olarak fikse edilmedikce parçalar bozulacaktır.

% 10’luk formal-salin en iyi fiksatiftir ve bütün halindeki bir beyin 3-4 hafta fikse edilmelidir. Büzülmeyi önlemek için 48 saat sonra formalin tazelenmeli daha sonra haftada bir tazelenmelidir. Beyin, injeksiyon ile de hızla tespit edilebilir. Preperasyonlar, parafin, selüloz nitrat, frozen ve smearler şeklinde olabilir.

MSS dokuları dens ve lipitten zengin olduklarından takip sıvıları ve sıvı parafin kolaylıkla penetre olmaz. Uzun takipler tavsiye edilir ve beyin çalışmaları için istenilen daha büyük bloklar parafinde 24 saat bekletilmelidir. Bu süre, parafinin son değişiminde vakum gömme fırını kullanarak azaltılabilir. Artifaklardan kaçınmak için, basıncı azaltmaya ve odacığa havayı yavaş yavaş tekrar almaya dikkat etmelidir. Hızlı takip teknikleri, non-neoplastik MSS dokuları için uygun değildir. Kesitler 7 ile 15-20 µm kalınlığında alınır. Albumin veya jelatin gibi yapıştırıcılara gereksinim vardır. Kesitler 37⁰C de 15-24 saatte kurutulmalıdır. 60 derecede uygulanan daha kısa periyodlar tercih edilmemelidir.

Daha geniş, daha kalın kesitler istendiğinde selüloz nitrat kesitler kullanılmaktadır. Bu ortama gömmek için hiçbir özel tekniğe gerek yoktur ancak tam bir impregnasyon sağlanmalıdır. Dokunun yoğunluğundan ve büyüklüğünden dolayı takibin tamamlanması için uzun bir süreye (2 ay kadar) gereksinim vardır. Hızlı yöntemler bu materyele uygulanmaz. MSS’ nin selüloz nitrat kesitleri yaklaşık 15 ile 25-30 µm arasında kesilebilir.

Frozen kesitler, nörohistolojide çok kullanılır. Bazı yapılar sadece bu tip kesitlerin kullanımı ile gösterilebilir. Fazla lipit içeriklerinden dolayı hemen donmazlar ve nörohistokimya ve nöropatolojide sıklıkla istenen biyopsi materyellerinin hazırlanmasında tercih edilirler. Smearler, bazı metastazlar gibi daha kollajenöz beyin tümörleri hariç, beyin tümörlerinin hızlı teşhisi için uygun olabilmektedir.

Tespit edilmemiş küçük bir doku parçası 2 lam arasına konulup, sıkıştırılır, hızla alkol veya alkolik bir fiksatifle tespit edilirerek % 1'lik toluidin blue veya metilen blue veya hızla H-E ile boyanarak incelenebilir.

H-E, MSS'nin birçok özelleşmiş yapıları hakkında fazla detay vermez. Nissl boyası (cresyl viyole, thionin, azure), nükleik asitleri (DNA ve RNA) boyar. Bu boya sinir hücre büyüklüklüklerinin ve sayılarının saptanması için yararlıdır. RNA, sitoplazmada serbest ribozomlarda ve GER de de bulunduğundan (Nissl cisimcikleri) nöronların gösterimi için uygundur. Van Gieson’ un pikro-fuksini de nörohistolojide çok kullanılmaktadır. Bu yöntemle küçük kan damarlarının kollajen fibrilleri belirgin olarak görülür, kollajen ve glial fibriller kolaylıkla ayırt edilebilir. Weigert' in demirli hematoksileni kullanıldığında, demiyelinizasyon alanları ayırt edilebilir. Mallory' in fosfotungustik asit hematoksileni de özellikle glial fibriller için yaygın olarak kullanılmaktadır. Nörohistoloji ve nöropatolojide Nissl-tip boyama sıklıkla kullanılmaktadır. Daha özel tekniklerden en önemlisi miyelin boyama ve metalik impregnasyon yöntemleridir. Bu yöntemlerle nöronlar, sinir fibrilleri, nörofibriller ve uzantıları ile birlikte çeşitli glial hücreler gösterilir.

MSS' de Nissl Maddesinin Gösterimi:Bazik boyalarla boyanırlar. Metil green pyronin ile zengin RNA içermesinden dolayı güzel boyanırlar. Uygulanan yöntemler:

1- Cresyl fast violet boyaması

2-Einarson’ un gallocyanine yöntemi:Hiçbir differansiyasyon gerektirmeyen progressif bir boyama yöntemidir.

Fosfotungustik Asit Hematoksilen Boyası

Fiksasyon : %10'luk formalin

Kesit : 6 mikron kalınlığında parafin kesit.

A-% 5'lik sulu KMNO₄

B- % 2'lik sulu oksalik asit

C- % 4'lük sulu ferric ammonium sulphate

D- Phosphotungustic asit hematoksilen:

Hematoksilen 0.5 gr

Phosphotungustic asit 10 gr

Distile Su 500 cc

% 0.25 sulu KMNO₄ 25 cc

Hematoksilen 100 cc suda hafif ateşte çözülür. Geri kalan 400 cc' de ateşte phophotungustic asit çözülür. Soğuduğu zaman iki karışım karıştırılır ve üzerine KMNO₄ eklenir.

Teknik:

1. Suya indirme

2.%5'lik permanganatta 5 dakika

3.Distile suda çalkalama

4.Oksalik asitte 5 dakika

5.Distile suda çalkalama

6.Ferric ammonium'da 1 saat.

7.Distile suda çalkalama

8.Phosphotungustic asit hematoksilende 3-4 saat

9.Distile suda yıkama

1O.Alkol serilerinden geçirme. Ksilende 1 gece

11.Entellan ile kapatma

Sonuç: Neuroglia hücreleri, miyelin, bazı fibriller, nükleus, kas mavi boyanır.

Nissl Granülleri İçin Gallocyanin Boyası

Fiksasyon: %10'luk Formalin

Kesit : 6 mikron kalınlığında parafin kesit.

Gallocyanin çözeltisi

Gallocyanin (Hartman, Leddon) 0.15 g

Chromiuum Potassium Sulfate 5 g

Distile Su................................. 100 cc.

Chromiuum Potassium sülfat sıcak suda eritildikten sonra üzerine gallocyanin ilave edilir ve dikkatlice 10 dakika kaynatılır. Daha sonra soğutulur ve süzülür. Çözeltiler 1 haftadan fazla saklanamaz.

Teknik :

1. Suya indirme

2.Kesitler gallocyanin çözeltisinde 3 saat 56 ° C'de eritilir.

3.Distile suda yıkanır

4.Alkol serilerinden geçirilir. Ksilende 1 gece bekletilir.

5.Entellan ile kapatılır.

Sonuç:

Nissl Granülleri.......... Mavi

Luxol fast blue/cresyl violet
Kluver and Barrera, 1954.

15 µm lik kesitler kullanınız.

• 
  Parafini ksilolle uzaklaştırınız.
  
• 
  % 100’luk alkole alınız.
  
• 
  95% alkole alınız.
  
• 
  Luxol fast blue çözeltisinde 2 saat 60^oC* de veya tercihen 37^oC de 1 gece boyayınız (Plastik kapaklı kavanoz kullanın).
  
• 
  95% alkolde yıkayın.
  
• 
  Distile suda çalkalayın.
  
• 
  Differansiyasyona 0.005% lithium karbonat ile 10 saniye olarak başlayın. Bu çözelti differansiyasyon yeteneğini birkaç kullanımdan sonra yitirdiğinden taze kullanılmalıdır.
  
• 
  %70 lik alkolde 30-60 saniye differensiye et.
  
• 
  Distile suda çalkalayın ve mikroskopta boyamayı kontrol edin.
  
• 
  Gri ve beyaz cevher belirgin olarak ayrılana kadar 3 kere tekrar edin. Çekirdekler renksiz, miyelin turkuaz renginde geri plan ise açık gri/mavi olmalıdır.
  
• 
  1% asetik asitteki 0.1 % cresyl violet ile 10 dakika boyayınız.
  
• 
  Distile suda yıkayın.
  
• 
  %70lik alkolde çalkalayın.
  
• 
  %70lik alkolde çekirdekler ve nissl maddesi menekşe-mor olana kadar differensiye et (yaklaşık 30 saniye).
  
• 
  Hızla % 100 lük alkolde çalkala, şeffaflandır ve kapat.
  
• 
  Sonuçlar
  
• 
  Miyelin - mavi.
  Eritrositler- turkuaz.
  Çekirdekler ve Nissl maddesi - menekşe-mor
  
• 
  * 2 saatlik kullanım zamanı için differensiasyon için 0.05% lithium karbonatı 0.005%, lik yerine kullanabilirsiniz. Bu çözelti daha hızlı çalıştığından dikkatli olmalısınız.
  

Luxol fast blue çözeltisi
Luxol fast blue MBS - 1g
95% alkol - 1 litre
10% asetik asit- 5 cc

GÜMÜŞ ÇÖKTÜRME YÖNTEMLERİ:Altın ve gümüş tuzlarının kullanıldığı yüzlerce teknik vardır. Bu teknikleri ilk kez Ramon y Cajal kullanmıştır. Camillo Golgi (1843-1926) ve Santiago Ramon y Cajal (1852-1934) ın geliştirdikleri teknikler önem taşır. Bu araştırıcılar sinir doku gösterimi üzerine çalışmalarından dolayı 1906 Nobel ödülünü paylaşmışlardır. Bu yöntemler özellikle glial elementlerin gösterimi için uygundur. Her iki araştırıcı da sinir sistemi çalışmaları için bilimde çok önemli yer tutar. Golgi günümüzde hala sinir hücreleri ve fibrilleri için çok kullanılan birçok boya geliştirmiştir. Tekniğinde aldehit-osmiyum-dikromat çözeltisini fiksatif olarak kullanmıştır. Ardından gümüş tuzları ile impegne etmiştir. Perikaryonlar altın rengi uzantıları siyah olarak gösterilebilir. Nöral dokuların şekillerini ve bağlantılarını ortaya koymuşlardır. Gümüşleme ile nöronlar ve glial hücreler gösterilebilir. Ramon y Cajal tekniğinde gümüş çöktürüldüğünde nöronlar sarı/turuncu renkte, nörofibriller kahverengi-siyah arası, nöroglialar ise siyah olur. Gümüşlemede sadece nöroglialar siyahlaşır.

Metalik çöktürme teknikleri, sinir hücre uzantıları ve retiküler fibrillerin gösteriminde standart bir yöntemdir. Metalik çöktürme ile gösterim, dokulardaki indirgeyici ajanlar yeterli güçte ise tek basamaklı bir tekniktir. Fakat fibrillerin çöktürme ile gösteriminde argirofil hücrelere benzer olarak genellikle 2 basamaklı indirgenme olur. Gümüş yerine altın da kullanılabilir.

Bazı metalik bileşikler dokular tarafından opak, genellikle siyah birikinti oluşturarak metalik duruma indirgenebilirler. Kolayca indirgendiğinden ve depo edilmiş gümüş stabil olduğundan Ag(NH₃)₂OH çözeltileri histoloji için çok uygundur. Melanin gibi tirozin türevleri ve intestinal bezlerin Kultschitzky hücrelerinde bulunan fenolik bileşikler Ag(NH₃)₂OH’ ı görülebilen birikim oluşturarak indirgerler. Bu tip hücreler arjentaffin hücreler olarak bilinir. Ag(NH₃)₂OH’ı direkt olarak indirgeyemeyen fakat dışarıdan eklenen bir indirgeyici ajanla gerçekleştiren hücreler argirofil hücreler olarak bilinir.

1-Golgi Teknikleri: Golgi çöktürmeler boya değildir. Bu teknikle tüm hücre gövdesi ve dendritler izlenebilir. Miyelinli aksonlar tuzları biriktirmezler. Miyelinsiz yapılar olan terminal son düğmecikler tuzlarla dolabilir. Uzun (bazıları birkaç ay) ve karmaşık yöntemlerdir. Sinir hücre ve uzantılarını dens siyah bir impregnasyonla gösterirler. Hücre iç yapısı kararırken, aksonlar ise genellikle sadece miyelin tabakası olmadığında impregne olurlar. Golgi' nin 3 yöntemi bilinmektedir. Hızlı, yavaş ve karışık olmak üzere

Yavaş Teknik:Küçük organ parçaları Müller çözeltisine veya % 3-5 kaliumbikromat çözeltisine atılır. Karanlıkta veya kahverengi bir şişe içerisinde 4-6 hafta saklanır. Bu süre sonunda deneme için bir parça alınır. Süzgeç kağıdı ile kurutularak % 0,75 ‘lik gümüş nitrat çözeltisinde 24 saat bırakılır. Hafifçe bistüri ile çok ince bir kaç kesit lama alınır, mikroskopta bakılır. Gümüş empregnasyonu (çökme) görülmezse kaliumbikromat çözeltisine bırakılır. Görülürse % 40’ lık alkol içerisinde yıkanır (1-2 saatte bir alkol yenilenir). Ardından % 80 ve % 90'lık alkollerden geçirilir. Absolu alkolde 12 saat bırakıldıktan sonra yarı yarıya eter- alkol çözeltisine aktarılır.

1 gün % 2 celloidin

1 gün % 4 celloidin

1 gün % 8 celloidin

% 8 celloidin ile bloklanır. Bloklar %96’ lık alkolde saklanır. Alınan kesitler yine % 96’ lık etil alkol içine alınarak ardından absolu alkolden geçirilir. Karbolksild konarak kapatılır.

Hızlı Teknik:Çok ince ve taze parçalar tercih edilir.

Golgi Çözeltisi

% 1’lik osmiyum acid 10cc

% 2,5 -3,5 kalium bikromat 40cc

2-3 mm kalınlığındaki 5-10 mm genişliğindeki doku parçaları dibinde cam boncuk bulunan kahverengi şişe içindeki Golgi çözeltisine aktarılır. 50 cc’lik Golgi çözeltisine bu büyüklükteki 6 parça konabilir. Parçaların çözelti içinde ne kadar kalacağı önceden söylenemez. Süre parçaya göre değişir. Onun için aynı yerlerden birkaç parça alıp atmalı ve zaman zaman (2-7 güne kadar) parçalar çıkarılarak papier buharla kurutulmalıdır. Parçalar % 0.75’ lik gümüş nitrat çözeltisine aktarılırak 1-2 gün bırakılır ( 48 saat ). Çözelti sararırsa veya bulanırsa yenilenmesi gerekir. % 40’ lık etil alkol içinde 1-2 saat yıkanır. Alkol sık sık yenilenmelidir. % 80–90 ve absolü alkollerden geçirilerek yarı yarıya eter-alkol eriyiğinde 1 gün ; % 2’ lik celloidinde 1 gün, % 4’lik celloidinde 1 gün bırakılır. % 8’lik celloidinde saklanır. Kesitler alınarak %96’lık etil alkol içine alınır. Ardından absolü alkolden geçirilerek karboliksilde konur kapatılır.

BİELSCHOWSKY TEKNİĞİ

Lam, lamel çok temiz olmalıdır. Yumurta akı hazırlanarak lamlara sürülür ve etüvde 1 gün kurutulur. Alınan parafin kesitleri ksilol ve alkollerden geçirilerek distile suya indirilir.

Kesitler 3 dakika KmnO₄ un % 0.75 çözeltisinde bırakılır.

Distile suda yıkanır.

Oksalik asitin %1 'lik çözeltisinde 5 dakika

Distile suda 1-2 saat (5-6 defa değiştirilecek ) yıkanır.

Gümüş nitratın % 2' lik çözeltisi 24-48 saat renkli şişede

Distile suda birkaç saniye çalkalama. Fazla kalırsa empregrasyon olmaz.

Gümüş nitratlı amonyak çözeltisinde 5-10 dakika .(% 10’lık gümüş nitrat 10 cc + % 40’lık NaOH 5 damla içinde cam yuvarlaklar bulunan renkli şişeye konur. Siyah bir çökelti verir. Dikkatle sallayarak damla damla amonyak eklenir. Her damladan sonra 10-15 saniye beklenir. Çözündükten sonra distile su ile 20 cc ye tamamlanır. Fazla NH₃ koymaktan sakınmalıdır. Eriyik bir pipetle 1cc kadar çekilir ve petri kutusu içindeki kesit üzerine dikkatle damlatılır.

Eter üzerinde veya süzgeç kağıdında kurutulur.

Distile suda 5-10 saniye (distile su dolu 2 cam bardağın ikisine de batırılıp çıkarılacak.

%10’luk formol çözeltisinde 10 dakika bırakılır. Formol içine koyar koymaz gri- siyah renk alır.

Çeşme suyunda 15 dakika bırakılır.

Distile suda 1-2 dakika yıkanır.

Altın klorürde 5-10 dakika (Altın klorürün % 1 lik eriğinden 5 damla +20 cc distile su + 1 damla asetik asit)

Natrium sülfat çözeltisinde 5-10 saniye ( Natrium tiyosulfat % 5 solusyonu hiposülfit

Bu eriyik içerisinde en fazla 1 dakika kalabilir).

Akar suda 1-2 saat yıkanır.

Alkoller , ksilol , kapatma.

KARIŞIK OLAN TEKNİK

Cox tarafından modifiye edilmiştir ve önerilmektedir.

• 
  Golgi-Cox yöntemi: Genç hayvanlarda bütün halinde beyne ve erişkin insan beyinlerinin büyük parçaları için uygundur. Parçalar 1 cm' den daha kalın olmamalıdır.
  
• 
  Bielschowsky’in aksonlar ve nörofibriller için yöntemi: En eski ve en güvenilir tekniklerdendir.
  
• 
  Holmes'in aksonlar için olan yöntemi: Hem MSS, hem de PSS' nin parafin kesitlerine uygulanabilir.
  
• 
  Aksonlar için Marsland Glees ve Erikson’un yöntemi: Formalin ile tespit edilmiş, parafine gömülmüş dokular için elverişlidir. Periferik sinirler için daha az güvenilir bir yöntemdir.
  

MSS‘DE MİYELİNİN GÖSTERİMİ: Miyelin Kılıf İçin Histokimyasal Boyalar

Normal miyelin aşağıdaki yöntemlerle gösterilir.

• 
  Osmiyum tetroksit: Miyelini siyaha boyar.
  
• 
  Hematoksilen Weigert'in miyelin boyası
  

• 
  Kulchizsky'nin Weigert’ in modifikasyonu
  
• 
  Loyez’ in miyelin için hematoksilen yöntemi
  
• 
  Woelcke (Heidenhein) nin miyelin yöntemi
  

• 
  Bakır pitocyanin ve diğer boyalar: Luxol fast blue MBS ve methasol fast blue 2G
  
• 
  Yağda çözünür boyalar ( sudan III, IV, sudan black B )
  
• 
  AltınKlorid/Formik Asit: Kas fibrilleri kırmızı, miyelin siyah, periferik sinir miyelini kırmızı, bağ dokusu sarı boyanır.
  
• 
  Metilen Mavisi ve Phloxine (MB&P): Metilen mavisi de Nissl boyasıdır ve hücre gövdesini maviye boyar. Phloxine, kollajen ve diğer hücresel olmayan yapıları parlak pembemsi kırmızıya boyar.
  
• 
  Wolke’nin Miyelin Kılıf Boyası: Miyelini maviye boyar. Arka plan şeffaftır. Glial hücreler ve nöronların çekirdekçiklerini ise siyaha boyar.
  
• 
  Hematoksilen- Phloxine–Safron (HPS): Çekirdekler mavi, sitoplazma, kas ve sinir fibrilleri kahve/kırmızı renkte boyanır.
  
• 
  Polarizasyon ve floresans mikroskopi
  

MARKSCHE’DEN BOYASI (Spielmayer, Benda)

Parçalar formolda tespit edilmelidir. Suya indirilen kesitlere aşağıdaki işlemler uygulanır.

1-%2,5 Demir alumda 24 saat

2-Distile suda bol yıkama

3-%70 alkol 10 dakika

4-%1 ‘lik tic. Hoema dan 1cc +99 cc distile suda 12-24 saat

5-Distile suda yıkama

6-% 2,5 Demir alum differensiasyon (teker teker mikroskop altında)

7-Distile suda yıkama

8-Alkol serisi

9-Kapama

Sonuç: Miyelinli sinir lifleri mor renge boyanır.
MSS’DE DEJENERE MİYELİNİN GÖSTERİMİ: Sinir fibrillerinin haraplanması ve nörolojik hastalıklar miyelinin dejenerasyonuna yol açmaktadır. Bu da miyelindeki lipid yapısının yıkımı ile hatta fagositoz ile uzaklaştırılmasıyla sonuçlanmaktadır. Bu oluşmadan önce dejenere miyelin pozitif boyanarak gösterilebilir.

• 
  Swank ve Davenport yöntemi
  
• 
  0smiyum tetroksit-alfa naphthylamin (otan) yöntemi
  

MSS‘de Nöroglia Hücre ve Fibrillerinin Gösterimi

• 
  Cajal'ın astrositler için altınklorür-sublimat yöntemi: Çok kullanılır.
  
• 
  Globust’un formalin ile tespit edilmiş materyeller için olan yöntemi
  
• 
  Hortega’ nın astrositler için gümüş karbonat yöntemi
  
• 
  Mallory’in fosfotungustik asit hematoksileni: Fibröz astrositlerin hiperplazi ve hipertrofisinin gösterimi için çok yararlıdır. Parafin veya selüloz nitrat kesitlerde kullanılabilir.
  
• 
  Holzer'in fibröz glia için yöntemi: Glial fibrosisin gösterimi için uygundur.
  
• 
  Hortega’nın oligodendrositler ve mikroglia için gümüş karbonat yöntemleri
  
• 
  Penfield’in kombine oligodendroglia ve mikroglia yöntemi
  
• 
  0ligodendroglia, mikroglia ve astrositler için hızlı yöntem
  
• 
  Patolojik glialar için Weil-Davenport yöntemi: Glial tümörler, gliosisin gösterimi için uygundur.
  

PERİFERİK SİNİR SİSTEMİ: MSS nin sinir fibrilleri ve miyelin tabakalarını çalışmak için uygulanan yöntemler PSS'deki aynı yapılar için uygun değildir. PSS’de sinir demetleri ve fibrilleri kas ve bağ dokusu içinde bulunduğundan, bu yapılardan ayırt etmek özellikle gümüş çöktürme yöntemleri ile zor olmaktadır. Bu iki sistemin miyelin tabakaları arasında da yapısal farklar vardır. Parafin takibi sırasında özel bir fiksasyon uygulanmadıkça PSS’de MSS’e göre daha fazla miyelin kaybı olduğuna ilişkin bulgular vardır. Dejenere miyelin MSS de olduğu gibi Marchi yöntemi ile veya Davenport modifikasyonu ile gösterilebilir.

PSS de Miyelinin Gösterimi

1-Osmiyum Tetroksit Yöntemi: Hem normal hem de dejenere miyelin gözlemleri için en iyi ve en basit yöntemdir. Dezavantajı pahalı ve tehlikeli olmasıdır. Taze veya formalin ile tespit edilmiş dokular kullanılabilir.

2-Hematoksilen Yöntemi: Miyelin için çoğu hematoksilen boyaları periferik sinirlerin gösterimi için kullanılırlar fakat hızlı bir gösterim için, parafin kesitlerini kullanarak, Weil yöntemi, Loyez yöntemi yerine tercih edilir. Uygulanan yöntemler:

• 
  Miyelin için modifiye Weil hematoksilen yöntemi
  
• 
  Gutmann ve Sanders yöntemi
  

3-Solochrom cyanine: Periferal sinirlerin miyelinini göstermekiçin basit ve hızlı yöntemdir.

Periferik Sinir Fibrillerinin Gösterimi: Aşağıdaki yöntemler, deride, kasta ve daha geniş sinir demetlerinde kullanıldıklarında özellikle yararlı ve güvenilirdir.

Frozen kesitler için modifiye Schofield’in gümüş çöktürme yöntemi

Parafin kesitler için ise Palkgren in gümüş çöktürme yöntemi.

Sinir Sonlanmalarının Gösterimi: Sinir sonlanmalarının gösterimi için 2 temel yöntem vardır. Bunlar metalik çöktürme ve vital boyamadır. Kolinesterazın histokimyasal gösterimi de birçok sonlanma alanlarını, özellikle de motor sonlanmaları gösterecektir.

Metalik Çöktürme Yöntemleri

• 
  Schofield yöntemi: Kutanöz sonlanmalar, kas iğcikleri
  
• 
  Winkelmann ve Schmit Yöntemi
  
• 
  Ranvier-Loewitt tekniğinin modifikasyonu: Kas iğcigi için
  

Vital Boyama Yöntemleri: Page’nin metilen blue yöntemi çok kullanılmaktadır.
KEMİK DOKUSU VE DEKALSİFİKASYON

Kemiğin mineral içeriği nedeni ile yumuşak dokular için kullanılan yöntemlerin modifikasyonlarının uygulanması gereklidir. En uygun teknik, parçanın ebatı ve yapısı, amaç, zaman ve elde mevcut olan aletlere göre değişebilmektedir.

Kemik ve patolojik olarak kalsifiye olmuş yumuşak dokuların genellikle kesit almadan önce kalsiyum tuzlarının uzaklaştırılması gerekirken dekalsifiye edilmemiş kemiklerin ve dişlerin preperasyonunun özel yöntem ve aletlerle yapılması mümkündür. Herhangibir yöntemle dekalsifikasyon başlamadan önce, dokular iyice tesbit edilmelidir. Aynı anda dokuyu tespit ettiği ve dekalsifiye ettiği farzedilen asit- fiksatif karışımları tatmin edici değildir. Histolojik araştırma için seçilen kemik hemen ince parçalara ayrılmalıdır. Bu iki nedenden dolayı gereklidir.

• 
  Dens doku içine fiksatifin girişine izin vermek için,
  
• 
  Dekalsifiye için gerekli süreyi azaltmak için (çünkü asit çözeltilerdeki uzun süreli immersiyon daha sonraki boyamayı ciddi biçimde zayıflatır).
  

3-5 mm’lik kemik parçaları ince diş testeresi ile motorlu testere ile kolaylıkla kesilebilir. Hangi yöntem kullanılırsa kullanılsın dokunun kesit yüzeyinde veya daha derininde küçük kemik parçaları, kıkırdak veya yumuşak dokular birikecektir. Mikroskopik olarak kemik tozları 2 formda görülebilir. Birincisi, kesitin kenarlarında çok sık rastlanan kemik veya kıkırdak kıymıkları; diğeri ise 200-700 µm çapında yuvarlak döküntüler şeklinde az rastlanan bir artifarktır. Kemik tozlarının hiç oluşmaması pek mümkün değildir ancak keskin testereler kullanılarak kemiği fazla hırpalamadan azaltılabilir.

%10’luk nötral formal–salin dekalsifikasyondan önce yeterlidir. Yassı, sert kemikler en azından 48 saat ya da daha fazla fikse edilmelidir. Dokuları radyoopak yaparak , dekalsifikasyon için bir test olan x-ray kullanımını da engellese de formal–sublimat da primer fiksatif olarak tavsiye edilmektedir. Acil kesite gereksinim varsa fiksasyon kısa olmalıdır ve çok ince kemik parçaları (2-3 mm) 60⁰C’de %10’luk formal–salinle 2 saate uygun biçimde fikse olabilir.

Eğer kemikteki ve diğer dokulardaki kalsiyum tuzları gösterilmek istenirse tüm asit çözeltilerin kullanılmasından kaçınılması gereklidir ve fiksasyon nötral formalinde veya alkolde yapılmalıdır. Kemik blokları, diğer bloklarla birlikte tespit edilmemelidir. Çünkü kopan kemik parçaları, yumuşak dokuları zedeleyebilir.