Işik mikroskopik teknikler

8-KAPATMA (Mounting): Boyanan kesitlere bir damla Kanada balzamı veya entelan damlatılır. Lamel kapatılır, hava kabarcıkları çıkartılır. Bu maddeler hem mikroskopta inceleme için uygun kırma indisi sağlar hem de boyanmış kesitlerin yıllarca korunmasını sağlar.

RUTİN EL TAKİBİ (3-5 mm kalınlığındaki bloklar için)

1-Tespit

2-Eğer gerekli ise suda yıkamak

3-% 70’lik alkol 3-8 saat

4-% 90’lık alkol 1 gece (16 saat)

5-Absolu alkol 2 saat

6- Absolu alkol 3 saat

7- Absolu alkol 3 saat

8-Toluen veya kloroform 16 saat

9-Erimiş parafin 1 saat

10- Erimiş parafin 1 saat

11- Erimiş parafin 1 saat

12- Parafine gömme

HIZLI EL TAKİBİ (3 mm den kalın olmayan bloklar)

1-Carnoy fiksatifinde 30-60 dakika tespit

2- Absolu alkol 30 dakika

3- Absolu alkol 30 dakika

4- Absolu alkol 30 dakika

5-Ksilen ve toluen 15-30 dakika (Şeffaflanıncaya kadar)

6- Erimiş parafin 20 dakika

7- Erimiş parafin 20 dakika

8- Erimiş parafin 20 dakika

9- Parafine gömme

HIZLI EL TAKİBİ (Bölümümüzde uyguladığımız)

1-Bouin fiksatifinde tespit 6-7 saat

2-Çeşme suyunda yıkama

3-% 70’ lik etil alkol 60 ⁰C’lik etüvde 1 gece

4-% 96’ lık etil alkol 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

5-% 96’ lık etil alkol 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

6-Absolü alkol 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

7-Absolü alkol 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

8- Ksilen 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

9- Ksilen 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

10- Erimiş parafin 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

11- Erimiş parafin 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

12- Parafine gömme

HIZLI EL TAKİBİ (Bölümümüzde uyguladığımız)

1-Tamponlanmış nötral formalin ile tespit

2-% 50’ lık alkol 60 ⁰C’lik etüvde 30 dakika

3-% 70’ lik etil alkol 60 ⁰C’lik etüvde 30 dakika

4-% 80’ lik etil alkol 60 ⁰C’lik etüvde 30 dakika

5-% 96’ lık etil alkol 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

6-% 96’ lık etil alkol 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

7-% 100’ luk etil alkol 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

8-Absolü alkol 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

9-Absolü alkol 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

10- Ksilen 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

11- Ksilen 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

12- Erimiş parafin 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

13- Erimiş parafin 60 ⁰C’lik etüvde 1 saat

14-Parafine Gömme

PARAFİN TEKNİK (SCEHFIELD ÜNİVERSİTESİ)

1-Fiksasyon

2-% 70’ lik etil alkol 2 saat

3-% 80’ lik etil alkol 1 saat

4-% 90’lık etil alkol 1 saat

5-Absolü alkol 1.5 saat

6-Absolü alkol 1.5 saat

7-Kloroform 1 gece

8- Kloroform 1.5-2 saat

9- Erimiş parafin 1.5 saat

10-Erimiş parafin 1.5 saat (vakumla)

11-Parafine Gömme

JB-4 TEKNİĞİ
Sert bloklardan ve geniş yüzeyli bloklardan çok ince kesit alınmasında kullanılır. JB-4 Kiti içinde Çöz:A, Çöz:B ve katalizör bulunur. Polysciences INC-İngiltere’ den alınabilir.

1-Formaldehit veya gluteraldehitle fiksasyon

2-İnfiltrasyon çözeltisi:

JB-4 A çözeltisi 50 cc

Katalizör 0.45 g

Çeker ocakta eldiven ile çalışılır. Katalizörün erimesi için hafifçe 30 dakika karıştırın.

Gömme çözeltisi:

25 cc katalizlenmiş JB-4 çözeltisine 1 cc JB-4 Çözelti-B eklenir. Hafifçe çalkalanır, 10-15 dakika içinde kullanılmalıdır.

Yöntem

1-% 70’ lik etil alkol 90 dakika (az olmayacak)

2-% 80’ lik etil alkol 60-90 dakika

3-% 90’lık etil alkol 60-90 dakika

4-% 95’lık etil alkol 90 dakika (az olmayacak)

5-% 100’ lük etil alkol 60 dakika

6-% 100’ lük etil alkol 60 dakika

7-Katalizlenmiş Çözelti A 1 gece

8-Gömme çözeltisine gömülür, sertleşene kadar 1-2 saat beklenir.

9-Kesit alınır.

NOT:Tüm kit aynı gün açılıp kullanılmalıdır. Dokuyu gömerken eğer büyükse çeker ocakta trimlenir. JB-4 gömme bloklarına dökülür, dokular yerleştirilir, üstüne takozlar yerleştirilir, buzdolabında 1-2 saat polimerize edilir.
JB-4 KESİTLER İÇİN ASİT FUKSİN-TOLUİDİN BLUE BOYAMA YÖNTEMİ

1-% 1’ lik sulu asit fuksin 2 dakika

2-Distile su 1 dakika

3-% 0.05’ lik toluidin blue (pH=4.4 olan asetat tamponu ile hazırlanmış 2 dakika

4-Distile su 30 saniye

5-Havada kurutma

6-Entellan ile kapama
JB-4 KESİTLERDE GLİKOJEN İÇİN PAS REAKSİYONU TEKNİĞİ

1-% 1’ lik periyodik asit 5 dakika

2-Yıkama 1 dakikadan fazla olmasın

3-Schiff reaktifi 15 dakika (oda ısısı)

4-Akarsu 15 dakika

5-Gills Hematoksileni 2 dakika

6-Suda çalkalama

7-Alkollerde dehidrasyon

8-Ksilollerde şeffaflandırma

9-Kapatma

Sonuç:Glikojen partikülleri pembe boyanır.

Kontrol Kesit Kullanımı:Her 1 cc distile su için 1 mg amylase kullanılır. Kesitleri 37 ⁰C’ deamylase’ da en az 3 dakika (saatler) bırakılır. PAS reaksiyonunu uygula. Amilaz glikojeni sindirdiğinden glikojen alanları ortadan kalkacaktır.
KARBONHİDRATLARIN GÖSTERİMİ

Dokularda karbonhidratları içeren bileşikler bulunmaktadır. Bunlar homopolisakkaritler (glikojen, nişasta ve sellüloz ) veya heteropolisakkaritlerdir ( glikozaminoglikanlar, glikoproteinler,proteoglikanlar proteoglikan aggregatları ve glikolipidler).

Homopolisakkaritler:Glikojen, hayvansal dokularda çok bulunan bir homopolisakkarittir. Tesbit edilmiş dokuların parafin bloklarında korunabilir. Nişasta ve selüloz ise bitki hücrelerinde bulunan homopolisakkaritlerdir. Glikojen, glikoz zincirlerinden oluşan ve doku ölümünden sonra hemen şekere dönüşen labil bir bileşiktir. Fiksasyondan önce suda çözünür. Best’in uyguladığı glikojen gösterimi için carmin yöntemine kadar glikojenin sadece absolü alkolde hemen fikse edilebilirse korunabildiğine inanılmakta idi. Artık çok değişik yöntemlerle glikojen gösterimi mümkündür.

Elektronmikroskobunda glikojenin 2 temel formda gözlenir.

Alfa Formu:60-250 nm çapındaki beta partiküllerinin rozetleri veya demetleri şeklinde bulunurlar.

Beta Formu:Ya tek tek ya da rozet formasyonun parçası olarak ve 20-40 nm çapında parçacıklardır.

Gamma formu: 3.form olarak fare karaciğerinde açıklanmıştır.

Glikojen intrasitoplazmiktir. Karaciğer, kalp kası ve iskelet kasında çok fazla miktarda, kıl folikülleri, endometrial bezler, vajinal ve servikal epitelde (miktar hormonal duruma göre değişir) önemli miktarda bulunmaktadır. Göbek kordonu, nötrofiller ve megakaryositler de glikojen içermektedir. Dokularda glikojen bir protein çevrede görülür. Proteinlere kimyasal olarak bağlanmazlar.

Heteropolisakkaritler:Sıklıkla karışımlar halinde bulunan farklı bileşiklerdir. Musinler, dokularda maddeleri veya bezlerin sekresyonlarını açıklamak üzere kullanılmaktadır. Bunlar, alkol ve asetik asit ile presipite olurlar ve mucicarmin ile boyanırlar. Heteropolisakkaritler; nötral veya asidik olabilirler. Bir nötral heteropolisakkarit, glukozamin gibi genellikle asetilleşmiş hekzoz ünitelerinden oluşan karbohidrat içermektedir.

1-Glikozaminoglikanlar (Asit heteropolisakkaritler-asit mukopolisakkarit):Daha çok karbohidratın yapıda bulunduğu polisakkarid– protein kompleksleridir (Hyaluronik asit, kondroitin sülfat, dermatan sülfat, heparan sülfat, keratan sülfat gibi). Karboksillenmiş glukoz üniteleri içerirler. Yapılarındaki karbonhidratlar tekrarlayan disakkarit ünitelerdir (Glukorinik asit+glukozamin; iduronik asit+galaktozamin gibi). Hidroksil, karboksil ve sülfat gruplarından zengin, polianyonik ve hidrofilik maddelerdir. GAG lar sülfatlı ya da sülfatsız GAG lar olarak ikiye ayrılır. Hyaluronik asit, glukozamin ve glukorinik asit zincirlerinden oluşan basit sülfatsız glikozaminoglikandır. Kompleks glikozaminoglikanlar, glukorinik aside ilave olarak sulfatlanmaş glukozamin üniteleri de içerirler. Kondriotin sülfat, kıkırdak ve bağ dokularında çok bulunan bir kompleks glikozaminoglikandır, Heparin de yine sulfatlı glukozamin ve glukorinik asit bileşiminde bir glikozaminoglikandır. Dermatan sülfat ve Keratan sülfat da yine sulfatlı kompleks glikozaminoglikanlardır.

2-Glikoproteinler: Yapıda daha çok proteinlerin bulunduğu polisakkarid – protein

kompleksleridir ( Laminin, fibronektin, hemonektin, osteonektin, kondronektin gibi ). Karbonhidratlar genellikle dallanmış oligosakkaritlerdir. Glikoproteinler predominant olarak protein oldukları halde genellikle % 4’ den fazla hekzozamin içeren polisakkaritlerdir.

3-Glikolipidler:Polisakkarit-yağ bileşikleridir. Genellikle galaktoz olan bir karbonhidratla yağ asitlerinin birleşmesi ile meydana gelir.

4-Proteoglikanlar:Glikozaminoglikanlar bir proteine bağlandıklarında proteoglikanlar oluşur. Tüp fırçası görünümleri vardır.

5-Proteoglikan Aggregatları:Bir hiyaluronik asit zincirine bağlanmış protein ve glikozaminoglikan monomerlerinden(proteoglikanlar) oluşur. Kıkırdak matriksinin ana bileşenini oluştururlar.

6-Sialomusinler:Polisakkarit içeriği fazla olduğunda (%20’nin üstü), sialik asit genellikle bulunur. Sialik asit içeren musinler sialomusinler olarak bilinmektedir.

Karbohidratların Boyanma Reaksiyonları

Dokulardaki bu maddeler periyodik asit Schiff reaksiyonu ve bazik boya yöntemleri veya her iki metodun kombinasyonları ile gösterilmektedir. En çok kullanılan bazik boya Alcian blue’dır. Azur A ve thionin gibi metakromatik boyalar da kullanılabilmektedir. Kolloidal demir ve high demir diamin, asidik gruplarla birleşerek Alcian blue gibi hareket edebilir ve benzer sonuçlar elde edilebilir. Fakat glikojen için Best carmin ve iodine, musinler için ise musicarmin mükemmel sonuçlar verdiği için daha sıklıkla kullanılmaktadır. Gümüş çözeltileri, glikojenin oksidasyonu ile oluşan aldehitleri indirgerler. Bu yöntem PAS reaksiyonuna büyük benzerlikler göstermektedir. Daha az kullanılan teknikler ise fluorokrom boyalar veya floresans antibodiler kullanarak floresans mikroskopta inceleme veya radyoaktif kükürt 35 ile in vivo işaretlenmiş dokuların otoradrografik incelenmesi ile olmaktadır. Ayrıca, bloklama teknikleri, enzim yöntemleri, kritical elektrolit konsantrasyonu ile de gösterilebilirler.

PERİYODİK ASİT – SCHİFF (PAS) REAKSİYONU

Gerçek bir histokimyasal yöntemdir ve deoksiribonükleik asit gösterimi için kullanılan Feulgen reaksiyonunun geliştirilmiş şeklidir. Feulgen reaksiyonunda hidroklorik asit ile hidroliz, aldehit gruplarını serbest bırakır ve aldehitler Schiff reaktifini tekrar renklendirirler. Bu yöntemde karbonhitradlardaki komşu 1:2 glikol grupları (CHOH-CHOH) periodik asit ile kırılır ve aldehidlere dönüştürülür (iki CHO grubu). Aldehitler de Schiff reaktifi ile gösterilir. Reaksiyonunun temeli, aldehit gruplarının bisülfit oluşturma özelliğine dayanmaktadır. Boya olarak kullanılan fuksin veya benzer yapıdaki boyalar asit solusyonlarla muamele edilirse renksiz bir bileşik meydana gelir. Buna leucofuksin denir. Bu bileşik daima yalnız bir aldehit grubu ile reaksiyona girerek, renkli bir bileşik meydana getirir. Bu reaksiyon oluşmuşsa PAS pozitif olarak adlandırılır. PAS pozitif reaksiyon veren maddeler şunlardır.

• 
  Glikojen, nişasta, selüloz
  
• 
  Glikozaminoglikanlar
  
• 
  Nötral mukopolisakkaritler
  
• 
  Glikolipidler (cerebrosidler, feronazin, kerazin)
  
• 
  Glikoproteinler (Fibronektin, hemonektin, laminin, osteonektin, kondronektin
  
• 
  Sero- mukoid
  
• 
  Seroglikol
  
• 
  Koryonik gonadotropin, hipofiz gonadotropini
  
• 
  Lipidler, fosfolipidler (sefarin, kepharin, fosfotidil serin, spingomiyelin)
  

PAS REAKSİYONUNUN UYGULANIŞI

A. Periyodik asit çözeltisi:

Periyodık asit........................................ 1 gr

Distile su ...............................................200 cc

B.Schiff Reaktifi

Üç şekilde hazırlanabilir.

I-200 cc kaynamış su içinde 1 gr bazik fuksini çözün. Çözeltiyi 50 dereceye kadar soğutun ve 2 gr potasyum metabisülfit (K₂S₂0₅) ekleyerek karıştırın. Oda sıcaklığına düştüğünde 2 cc konsantre HCl ekleyin ve karıştırın ve buna 2 gr aktif kömür ekleyin ve karanlıkta, oda ısısında bir gece bırakın. 1 nolu Whatman filtre kağıdından süzün. Çözelti ya şeffaf ya da soluk sarı renkte olmalıdır. + 4 C de karanlıkta muhafaza edilmelidir.

II- 200 cc distile su kaynarken 1 gr bazik fuksin konur. Beş dakika karıştırılır, soğutulur ve süzülür. 2 gr potasyum metabisülfit ve 10 cc % 10' luk HCl ilave edilir. buzdolabında 24 saat bekletilir. Oda ısısına çıkardıktan hemen sonra 0.5 gr karbon tozu atılır, 1 dakika çalkalanır ve 4 kat kalın süzgeç kağıdı ile süzülür. Süzülen çözelti berrak renksiz olması şarttır.

III-0.5 gr bazik fuksin, 15 cc % 10 luk HCl ile karıştırılır, sallanarak eritilir. 0.5 gr potasyum metabisülfit, 85 cc distile suda eritilir. Her iki eriyik karıştırıldıktan sonra tekrar kırmızı bir eriyik meydana gelir. 24 saat bekletilir. Rengi sararmış olan çözeltiye 0.5 gr aktif kömür tozu katılır. 1-2 dakika sallanır ve 4 katlı kalın süzgeç kağıdından süzülür. Süzülen çözeltinin berrak renksiz olması gereklidir. Schiff reaktifi buzdolabında saklanmalıdır. oda ısısında çabuk bozulur ve pembeleştiğinde kullanılmamalıdır. Birkaç hafta dayanıklıdır. Bozulup bozulmadığını şöyle anlayabiliriz. Birkaç damla Schiff reaktifi, cam kapta bulunan % 37 -40' lık formaldehit çözeltisine konur. Hemen kırmızımsı mor olursa kullanılır. Koyu mavi mor ya da reaksiyon geç olursa bozuktur, kullanılmaz.

YÖNTEM

1.Kesitler distile suya indirilir

2.Periyodik asit ile 5 dakika

3.Distile suda çok iyi yıkayın

4.Schiff reaktifi ile 15 dakika

5.Akarsuda 5-10 dakika yıkayın. Ya da 5 er dakika 3 kez taze

hazırlanmış yıkama çözeltilerinin biri ile yıkayın.

Yıkama çözeltisi

Distile su.........100cc

Metabisülfit.....500gr

Yıkama çözeltisi Çeşme suyu......................600cc

%10 luk HCl.................100cc

%10 sodyum bisülfit.......10cc

6-Akarsuda 10 dk. yıkanır.

7-İstenilen çekirdek boyası ile boyanır (Haemalum da 4 dk.).

8-Çesme suyunda 30 dk. yıkanır

9-Alkol serileri, ksilol, kapatma

Sonuçlar

Çekirdekler mavi

Glikojen ve diğer PAS pozitif reaksiyon veren alanlar erguvan rengi, menekşe

AÇIKLAMALAR

1. Reaksiyonun yoğunluğu, periyodik asit ve Schiff çözeltisinde bekletilme süresine bir miktar dayanmaktadır. Uygulayıcıya bağlı olarak değişir.

2. Metabisülfitle çalkalama genellikle gereksizdir.

3. Demirli hematoksilen PAS tekniğinde çekirdek boyası olarak çok kullanılır ancak Harris gibi alum hemotoksilenler de çok iyi sonuçlar vermektedir.

BEST CARMiN (Glikojen İçin)

Doku parçalarının absolü alkolde tespit edilmesi önerilir.

Stok Çözelti

Carmin 2 gr

Potasyum karbonat 5 gr

Distile su 60 cc

Karıştırılarak birkaç dakika kaynatılır. Bol köpük oluşur. Soğutulur. 20 cc amonyak eklenir. Karanlıkta muhafaza edilir. Yazın 3 hafta, kışın 2 ay dayanıklıdır. Kullanmadan önce süzülmelidir.

Uygulama Çözeltisi

Stok best carminden 20 cc süzülür, üzerine 30 cc amonyak ve 30 cc metil alkol ilave edilir, karıştırılır. Bu çözeltinin hemen kullanılması lazımdır, 15 saat sonra bozulur.

Yöntem

1-Kesitler deparafine edilip % 70’ lik alkole kadar indirilir.

2-% 70^’ lik alkolden çıkarılan kesitler direkt olarak hematoksilende 5, 10, 20 dakika kadar boyanır.

3-Distile suda yıkanır.

4-Best Carminde 10, 20, 60 dakika bırakılır ( Ortalama 25 dakika).

5-Aşağıdaki differensiyasyon çözeltisinde diffarensiye edilir.

Metil alkol 40 cc

Absolu alkol 80 cc

Distile su 100 cc

Differansiyasyon çözeltisi 3 kaba bölünür. Kesitler üçünden ge­çirilir. Son kaptan boya çıkmamalıdır.

6- % 70 ‘lik alkolden başlıyarak % 80, 90, 96, 100 alkol serileri ile dehidre edilir.

7-Şeffaflandırılıp, kapatılır.

Sonuçlar:Glikojen kırmızı, nukleus mavi olur.

LİPİDLERİN GÖSTERİMİ

Basit tekniklerle gösterilebilen lipid miktarı genellikle kimya­sal analizle gösterilen miktardan çok daha azdır. Adipoz dokunun depo hücrelerindeki yağ ve sinir fibrillerindeki miyelin kolaylıkla boyanır. Fakat karaciğer, böbrek ve kalp gibi organların kesitlerinde bulunan lipidler gösterilemiyebilir. Var olan fakat basit tekniklerle gösterilemeyen böylesi lipidler maskelenmiş veya bağlı lipidler olarak bilin­mektedir. Bu lipid, özellikle protein gibi diğer doku bileşenleri ile kombinedir ve bu durumda parafin gömmesinde korunabilirler. Tamponlanmış formalin veya % l’ lik CaCl₂’ deki % 10' luk formalinle fiksasyon, genel amaçlar için tavsiye edilmektedir.

Lipid gösterim yöntemlerinde kontrol kesitlerin kul­lanımı önemlidir ve pozitif kontrol için Bayliss ve High, sıçan ve insan beyninden (fosfolipidlerin) , yağlı karaciğer ( trigliseridler ve yağ asitleri) ve atheroma veya adrenalden (kolesterol ve kolesterol ester­leri) cryostat kesitlerinin kullanımını tavsiye etmişlerdir. Negatif kontrol için kesitler 56 C de en az 30 dakika kloroform-metanol ekstrasyon karışımı ile işleme sokulur. Ekstrasyondan sonra bloklar azalan dereceli alkol serilerinden geçiri­lerek suya indirilir. Frozen kesitler alınır ve boyanır ve aynı yolla boyanan işlem görmemiş materyelle karşılaştırılır.

Lipidleri Boyama Yöntemleri

1-Yağda Çözünür Boyalar:Bunlar zayıf asidik diazo boyalardır ve suda çözünmeyen ve sadece alkolde ayrılabilen boyalardır. Lipidlerin çoğunda çözünürler ve bu nedenle dokulardaki lipidlerin gösteriminde çok kullanılırlar. Çözünürlükleri ile lipidleri renklendirdiklerinden lizokrom lar olarak adlandırılırlar. Bu boyalar:

1-Sudan III

2-Sudan IV( daha siyah)

3-Sudan Black B (en hassası)

4-Oil red O

Ençok kullanılan yöntem ise: Oil red 0-trietil fosfat yöntemidir.

2-Floresans Mikroskopi; Primer floresans, lipofuksinler olarak bilinen lipidlerin oksidasyon ürünleri ve lipidlerde çözünen karotonoid pig­mentler tarafından oluşturulur. Sekonder floresana, lipidlerde çözünen fluorokrom( örneğin fosfin 3R ) ca gösterilir.

3-Osmiyum tetroksit: Osmiyumun indirgeme mekanizması tam anlaşılamamıştır. Lipidler için bu pahalı ve hoş olmayan reaktif , dejenere miyelinin gös­terilmesi için özellikle uygundur.

4-Kolesterol gösterim yöntemleri

a-Digitonin reaksiyonu: Formalin veya formal kalsiyum fiksasyonu yapılır. Frozen kesitler, işlemi takiben polarizasyon mikroskobu ile incelenir.

b-Schulz reaksiyonu: Kolesterol esterleri için kullanılmaktadır.

5-Fosfolipidlerin gösterim yöntemleri

a-Baker' in asit hematein yöntemi

b-Plasmal reaksiyon (Feulgen ve Voit, 1924)

c-PAS yöntemi: Karbohidrat içeren lipidlerin (cerebrosidler ve gangliosidler) ve aynı zamanda aldehit içeren doymamış lipidlerin ve fosfolipidlerin gösteriminde kullanılır.

6-Asidik lipidler için yöntemler

a-Nötral ve asidik lipidler için Nile blue yöntemi

b-Feyrter' in inklüzyon yöntemi
PROTEİNLERİN GÖSTERİMİ

Proteinler organizmada ya saf proteinler olarak veya karbohidratlar veya lipidlerle kombine olarak bulunurlar. Hayvansal dokulardaki proteinler basit proteinler ve konjuge proteinler olarak ikiye ayrılır.

Basit proteinler

Globuler Proteinler: Albumin, globulin, histonlar

Fibröz Proteinler: Kollajen, retikülin, elastin, keratin, fibrin

Konjuge proteinler:Nükleroproteinler, gikoproteinler ve lipoproteinler

Tüm basit proteinler, hidroliz ile aminoasitlerine ayrılırlar. Proteinler çekirdeklerde bulunur ve nükleoproteinler olarak adlandırılırlar. Dokularda en yaygın proteinler kollajen, retikülin, elastik ve keratin gibi fibröz proteinlerdir. Bunlar suda çözünmezler fakat albumin, globulin gibi basit proteinler suda çözündüklerinden gösterilmeleri daha zordur.

Proteinlerin Saptanması ve Boyanması:Proteinlerin ve protein içeren bileşiklerin boyanma reaksiyonları amino asit yapısına ve boyama çözeltisinin pH' sına dayanmaktadır. Eğer protein karboksil gibi asidik gruplu çok sayıda aminoasitlerden oluşmuşsa, bazik boyalarla boyanan bir asit protein olacaktır. Eğer çok sayıda amino grupları(-NH₂) varsa asit boyalara affiniteye sahip bazik bir proteindir. Bazı amino asitler 1 amino ve 1 karboksil grubuna sahiptir ve nötral proteinlerdir. Buna benzer olarak yaklaşık eşit sayıdaki asidik ve bazik amino asitlere sahip proteinler de nötral olacaktır. Proteinlerin, asit veya bazik maddeler olarak iyonize olabilme yetenekleri ortam pH' sına bağlı olabilir. Boya çözeltisinin pH’sı, proteinlerin iyonize olmalarına izin verecek uygunlukta olmalıdır ki boyalarla birleşebilsin. Amfoterik boyalar veya doku bileşenleri, pH’larına bağlı olarak bazik veya asidiktirler. Bu faktörler, proteinlerin boyalarla boyanmalarında önemlidir. Fakat konjuge proteinlerin boyanma reaksiyonları karbohidrat veya lipit veya nükleik asit içeriğine de bağlı olacaktır.

Proteinlerin kusursuz histokimyasal reaksiyonları reaktif gruplarına bağlıdır. Bunlar bir amino asite veya bir tip proteine özgü değildirler. Amino grupları hemen hemen tüm amino asitlerde vardır fakat reaktif karboksil grupları, glutamik asit ve aspartik asit amino asitlerinde bulunur. Disülfit ve sülfidril grupları ise sistin, sistein ve metionin de bulunur.

Tablo: Proteinlerdeki aminoasitlerin reaktif gruplarının histokimyasal gösterimi

Reaktif gruplar	Aminoasitler	Histokimyasal Yöntemler
Amino grubu -NH2	İmino-asitler hariç hepsi	Ninhidrin-Schiff Bloklama teknikleri
Di sülfit grubu -S – S	Cystine	Performik Alcian blue
Sülfidril grubu -S - H	Cysteine	DDD Ferik ferrosiyanit reaksiyonu
Quanidil grubu	Arjinin	Sakaguchi
Fenil grubu	Tirozin	Millon
İndol grubu	Triptofan	DMAB-nitrit

Proteinlerin birçok bileşenden oluşmuş çok kompleks yapılar oldukları unutulmamalıdır. Bu yöntemler, proteinlerin yapısı hakkında çok az bilgi verirler. Ayrıca fiksasyon da korunmayı ve reaktif son grupların gösterimini etkileyebilir. Bu nedenle fiksasyon, yönteme uygun olmalıdır. Formalin fiksasyonu kısa olmalıdır ve osmiyum tetroksit zararlıdır, kullanılmamalıdır. Enzimler de spesifik aktiviteleri ile gösterilebilir. Immunglobulinler de doku kesitlerinde küçük hacimlerde olmalarına rağmen kesin olarak saptanabilirler. Antibodiler ve antijenler için immünofloresans ve immünoenzim yöntemleri uygulanabilir. Çok az miktardaki proteinler kesitlerde immünolojik teknıklerle gösterilebilir.