Microsoft Word haluk tezw 1
Yüklə 372,99 Kb. Pdf görüntüsü
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- ARAŞTIRMANIN TİPİ
- KULLANILACAK ARAÇ, GEREÇ VE YÖNTEMLER
- Şekil 1. Çalışmada saptadığımız Anaplasma phagocytophilum IFA IgG pozitif örneklerden biri (lökosit içinde floresans veren bakteri kümeleri (morula)
19
GEREÇ VE YÖNTEMLER ARAŞTIRMANIN YERİ Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı.
Trakya Bölgesi (Edirne, Kırklareli, Tekirdağ illerinin kırsal alanı). Bölge 2000 yılı nüfus sayımı verilerine göre toplam 564 560 kişiden oluşmaktadır. Nüfusun %38’i Tekirdağ, %37’si Edirne ve %25’i Kırklareli illerindedir. Örneklem grubu, tularemi seroprevalans çalışması (114) için 30 köyden toplanmış 1782 ve ek olarak kene ısırığının sık olduğu 3 köyden toplanmış 76 serum örneği içinden sırasıyla 98 ve 18 kene ısırığı öyküsü olan toplam 116 kişiden oluşmaktadır.
Kesitseldir.
Yaş, cins, yerleşim birimi, meslek, ev çevresinde hayvan besleme, doğada uğraş.
Erlihyoza özgü serolojik belirteçler (HGA IFA IgG).
20
Biyolog Günay Dedeoğlu-Kılınç’ın Trakya Bölgesinde Kırsal Alanlarda Tularemi Seroprevalansı adlı yüksek lisans tezi için 2006 yılının Mayıs-Ağustos aylarında toplanan serumlarda araştırma yapılmıştır. Bu tezde Dünya Sağlık Örgütünün seroprevalans çalışmalarında kullandığı yöntemlerden 30 küme yöntemine göre her ilden 30 köy belirlendi. Gönüllülere yapılacak işlem ve çalışma özetlendi ve ilgili formun (Ek-1) doldurulmasını müteakip kan örnekleri alındı. Eş zamanlı olarak Kırklareli kırsalında kene ısırığı fazla görülen üç köydeki gönüllülerden kan alındı. Bunlar santrifüj edildikten sonra serumları –70 0 C’de donduruldu. Daha önce toplanan bu serumlar içinden kene ısırılma öyküsü olan toplam 116 kişinin serumları ayrılarak, bu kişiler formda belirttikleri telefon numaralarından arandı. Hastalıkla ilgili bilgiler verilerek ve sözlü onayları alındıktan sonra indirekt floresan antikor yöntemi ile serolojik olarak erlihyoz antikorları araştırıldı. Pozitif çıkan serumlarda, çapraz reaksiyon ve koenfeksiyon açısından Rickettsia conorii, Treponema pallidium ve Borrelia burgdorferii antikorları araştırıldı. Bu çalışma Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu’ndan alınan izinle yapıldı (Ek- 2). Çalışmamız Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (TÜBAP)’ne sunulmuş ve TÜBAP-27 no’lu proje ile gerekli test malzemelerin alımı sağlanmıştır (Ek-3). Çalışmaya katılım gönüllük esası ve uluslararası Helsinki deklarasyonuna uygun şekilde sağlandı.
Yüzonaltı serum önce Anaplasma phagocytophilum IFA IgG (Focus Technologies, USA) ile test edildi. Pozitif çıkan serumlar (Şekil 1) çapraz reaksiyon ve koenfeksiyon açısından Rikettsia sp. IFA IgG (Focus Technologies, USA), Treponema pallidium hemaglütinasyon (TPHA) (OMEGA Diagnostics) ve Borrelia burgdorferii IFA IgG (ZEUS Scientific) testi ile bu mikroorganizmalara karşı oluşan antikorları bakımından araştırıldı.
1.
0 C’den çıkartıldı ve çözülmesi için bekletildi. Çözünen serumlar fosfat buffer solusyonu (PBS) ile 1/64 titrasyonda dilüe edildi. 2.
25µl IgG pozitif kontrol 25µl PBS ile iki kat sulandırıldı. 1/32 dilüsyon elde edildi ve slaytlardaki bir kuyucuğa 25µl eklendi. 3.
4.
Sonra diğer kuyucuklara 1/64 titrasyonda dilüe edilmiş 25µl hasta serumu eklendi. 21
5. 30±2 dakika 35-37 Cº’de inkübe edildi. 6.
7.
Sonra kaptan çıkarılıp distile su ile yıkandı ve havada kurutuldu. 8.
Her kuyucuğa 25µl IgG konjugatı eklendi. 9.
30±2 dakika 35-37 Cº’de inkübe edildi. 10.
Sonra PBS ile çalkalandı ve içinde PBS olan kapta 10 dakika bekletildi. 11.
Sonra kaptan çıkarılıp distile su ile yıkandı ve havada kurutuldu. 12.
Slaytların üzerine örtücü sıvı (mounting medium) konulup lamelle kapatıldı ve floresan mikroskopunda 400X büyütmede hemen değerlendirildi. 13.
Ilımlıdan yoğun elma yeşili floresan veren preparatlar 2-4 pozitif olarak değerlendirildi. 14.
Floresan var ama bulanık olanlar 1 pozitif olarak değerlendirildi. 15.
örneklerden biri (lökosit içinde floresans veren bakteri kümeleri (morula) görülmekte)
22
1.
0 C’den çıkartıldı ve çözülmesi için bekletildi. Çözünen serumlar PBS ile 1/4 titrasyonda dilüe edildi. Ardından Yolk Sac sulandırıcısı ile 1/64 titrasyonda dilüe edildi. Sonra 15 dakika oda ısısında bekletildi. 2.
dilüsyon elde edildi ve slaytlardaki bir kuyucuğa 25µl eklendi 3.
25µl tifus grubu pozitif kontrol IgG 25µl PBS ile iki kat sulandırıldı. 1/64 dilüsyon elde edildi ve slaytlardaki bir kuyucuğa 25µl eklendi. 4.
5.
Sonra diğer kuyucuklara 1/64 titrasyonda dilüe edilmiş 25µl hasta serumu eklendi. 6.
30±2 dakika 35-37 Cº’de inkübe edildi. 7.
Sonra PBS ile çalkalandı ve içinde PBS olan kapta 10 dakika bekletildi. 8.
Sonra kaptan çıkarılıp distile su ile yıkandı ve havada kurutuldu. 9.
Her kuyucuğa 25µl IgG konjugatı eklendi. 10.
30±2 dakika 35-37 Cº’de inkübe edildi. 11.
Sonra PBS ile çalkalandı ve içinde PBS olan kapta 10 dakika bekletildi. 12.
Sonra kaptan çıkarılıp distile su ile yıkandı ve havada kurutuldu. 13.
Slaytların üzerine mounting medium konulup lamelle kapatıldı ve floresan mikroskopunda 200X büyütmede hemen değerlendirildi. 14.
Ilımlıdan yoğun elma yeşili floresan veren preparatlar 2-4 pozitif olarak değerlendirildi. 15.
Floresan var ama bulanık olanlar 1 pozitif olarak değerlendirildi. 16.
Treponema pallidium hemaglütinasyon 1.
Reaktifler ve serumlar oda ısısına getirildi. 2.
Mikrotitrasyon pleytindeki bitişik kuyucuklarda hasta serumu ve sulandırıcı eklenerek 1/20 oranında sulandırılma sağlandı. 3.
4.
Pleytteki kuyucuklardan birine test digerine kontrol süspansiyonu eklenerek 1/80 dilüsyon elde edildi. 5.
Mikropleyti kapatılıp oda ısısında karanlık bir alanda 60 dakika inkübe edildi. Yüklə 372,99 Kb. Dostları ilə paylaş:
|