Phylogeny of the Zygomycota based on nuclear ribosomal sequence data

Harpellales + Orphella & Kickxellales + Spiro-

myces.—The Harpellales includes two families: Har-

pellaceae, all with unbranched thalli and having hosts

that are lower dipterans, and Legeriomycetaceae, all

with branched thalli associated with various nonpre-

daceous larval aquatic insect hosts with one exception

in isopods (Lichtwardt 1986, Lichtwardt et al 1999,

2001, White 1999). Only the Harpellales possesses

asexual spores called trichospores (specialized, de-

ciduous, monosporous sporangia) that often bear

nonmotile appendages (F

IG

. 3A, B, D, E, F and I).

Four types (I–IV) of sexually produced biconical

zygospores are recognized based on orientation of the

zygospore on the zygosporophore (F

IG

. 3C, E, G and

H) but Valle and Santamaria (2005) documented

unique zygospores for Orphella (see this section,

below). Key morphological taxonomic characters

among the Harpellales include the size and shape of

the spores (F

IG

. 3A–I), the number of appendages

per spore, number of spores per branchlet (F

IG

. 3A–E

and H), shape or nature (with or without adhesive

exudate or mucilage) of the gut anchoring holdfast

and arthropod host type.

The Kickxellales was validated by Benjamin (1979)

who also suggested that the Harpellales—itself vali-

dated by Lichtwardt and Manier (1978)—be consid-

ered in the Zygomycetes, but the Harpellales has been

accepted more broadly as Trichomycetes (Benny et al

2001). Although seemingly rare members of Kickxel-

lales are fairly common on dung and they also can be

isolated from soil and insect cadavers (Benny et al

2001, Kurihara et al 2004). The Kickxellales have

F

IG

. 3.

Phase contrast photomicrographs of living (refractive) Trichomycetes illustrating sexual and asexual reproductive

structures. A–I. Harpellales from aquatic insect larvae. A. Orphella catalaunica. Sporulating heads with attached cylindrical

asexual spores. B–C. Harpellomyces eccentricus. B. Trichospores with their appendages visible within generative cells. C.

Zygospore (Type III) arising from conjugated cells. D. Smittium culisetae. Trichospores attached to fertile branchlets. E, F.

Capniomyces stellatus. E. Attached, biconical zygospore (Type II) and immature trichospores. F. Released trichospores with

multiple appendages. G. Furculomyces boomerangus. Released bent zygospore (Type II) with a short collar. H, I. Genistelloides

hibernus

. H. Biconical zygospores (Type I) with swollen zygosporophores (similar to suspensors in Zygomycetes) attached to

two conjugated branches. I. Released trichospore with two appendages. J. Asellariales from a marine isopod, Asellaria ligiae.

Thallus attached by a holdfast cell to the hindgut cuticle and releasing small cylindrical arthrospores. Bars: A–I 5 20 mm; J 5

100 mm.

878

M

YCOLOGIA

---

grown from eight (Benjamin 1961, 1963, 1979) to 11

genera with the recent addition of Myconymphaea,

Mycoe¨melia and Ramicandelaber (Kurihara et al 2001,

2004), although Ramicandelaber did not cluster with

other Kickxellales in the present study (see F

IG

. 1).

Like Harpellales all members of Kickxellales have

monosporous sporangia, usually borne on specialized

fertile branches (sporocladia) (Benjamin 1979, Benny

et al 2001, Kurihara et al 2004). Most Kickxellales

have asexual spores that collect in a fluid droplet,

except for Spiromyces and Spirodactylon, which are dry-

spored at maturity (Ingold 1978); zygospores are

hyaline and globose with two or three undifferentiat-

ed suspensors (Benjamin 1958, 1959, Benny et al

2001). Septa within Kickxellales are centrally perfo-

rate with biconvex plugs that persist in acid stains and

weak base (Kurihara et al 2001). In addition a sac-like,

labyrinthiform organelle or abscission vacuole is

located just below the sporangial septum in Kickxella

and Linderina (Benny et al 2001).

Several different relationships between the Kickxel-

lales and Harpellales have been proposed (Benjamin

1979, Moss 1979, Lichtwardt et al 2001) in part due to

the paucity of taxonomic characters (with unknown

character states in many instances) and the challenge

involved in working with unculturable microfungi

(about 80% of Harpellales) (White 2006). The

specialized, asexual trichospores of the Harpellales

are produced laterally from generative cells with

aseptate collars, and they are homologous to the

monosporous sporangia (borne on pseudophialides)

of the Kickxellales with the exception of Spiromyces

(Benjamin 1966, Moss and Young 1978). Zygospore

production, although different in the two orders

(biconical versus globose), also has long been used as

evidence for the close relationship of the two orders

(Benjamin 1979). Other possible homologies include

cell wall composition, septal ultrastructure, immuno-

logical affinities and sterol spectrum (Sangar et al

1972, Moss and Young 1978, Moss 1979, 1998, Benny

and White 2001).

Molecular phylogenetic studies began with Walk-

er’s (1984) 5S rRNA analyses; however this locus

lacked sufficient signal to infer natural relationships.

O’Donnell et al (1998) used 18S rRNA data with

additional support from morphological and physio-

logical characters to infer a sister group relationship

between the Harpellales and Kickxellales. Gottlieb

and Lichtwardt (2001) demonstrated a similar pattern

adding culturable members of Harpellales but also

suggested that Smittium was polyphyletic. White

(2006) used 18S and 28S rDNA to add various

unculturable taxa and discovered that the Harpellales

were monophyletic except for Orphella, a topology

(F

IG

. 1) repeated here using two Orphella species and

a broadened dataset (all harpellids in the tree are

represented in F

IG

. 3A–I). Orphella was thought to be

one of the most derived genera of the Harpellales

(Lichtwardt 1986) and species have distinctive

specialized reproductive cells (Santamaria and Girbal

1998, Valle and Santamaria 2005) that at maturity

protrude beyond the anus of their stonefly hosts

(White and Lichtwardt 2004). As predicted by White

(2002) the discovery of unusual coiled zygospores in

Orphella (Valle and Santamaria 2005), in contrast to

those found in both the Harpellales and Kickxellales,

is consistent with its unique position in the combined

rDNA phylogeny. Valle and Santamaria (2005)

suggested that Orphella derived directly from a kick-

xellid ancestor, presumably from one resembling

Ramicandelaber brevisporus (Kurihara et al 2004, see

below).

Although the Spiromyces clade was resolved as either

a sister of the Kickxellales or Harpellales in previous

molecular phylogenetic analyses (O’Donnell et al

1998, Tanabe et al 2000, White 2002, 2006),

Spiromyces was supported strongly as a sister of

Orphella + Kickxellales in the current study (F

IG

. 1).

The inconsistent placement of the Spiromyces clade

might reflect the need (i) for more sequence data,

(ii) to reconsider the genus or (iii) to consider the

effect of long-branch attraction (hereafter 5 LBA, see

next section).

Dimargaritales

+

Neozygites,

Zoopagales

and

uncertain lineages.—Genes of some taxa of the weakly

supported clade consisting of the Dimargaritales,

Zoopagales and several other fungi might have

undergone accelerated evolution and the cluster

might not be natural due to LBA (F

IG

. 1). LBA is

the phenomenon in which taxa that are evolving at

different rates are artificially attracted to each other

due to biases inherent in the method of tree

reconstruction (Bergsten 2005). Notably the unex-

pected inclusion of entomophthoralean Neozygites

with Dimargaritales on the longest branches observed

results in the paraphyly of Dimargaritales. Ramican-

delaber, originally classified within the Kickxellales

(Ogawa et al 2001) and the cockroach parasite,

Nephridiophaga, formerly considered a protozoan un-

til an affinity to the Zygomycota was suggested with

18S rDNA molecular analysis (Wylezich et al 2004),

appear as a basal members of the clade but with weak

support. The clade should be evaluated further with

more slowly evolving protein coding genes. The

monophyly of the Zoopagales is not supported

because of the uncertain grouping of Zoophagus

insidians with Harpellales + Kickxellales, consistent

with a study based on 18S rDNA (Tanabe et al 2000).

Given the diversity of ecology and morphology of

W

HITE ET AL

: P

HYLOGENY OF THE

Z

YGOMYCOTA

879

---